反相HPLC 法测定行气止痛丸中羟基红花黄色素A 的含量

杨沫银 宋广莹

(1.内蒙古食品药品检验所，内蒙古 呼和浩特 010020;2.内蒙古商贸职业学院，内蒙古 呼和浩特 010020)

行气止痛丸为医院制剂方，收载于《中华人民共和国药品标准》蒙药分册(1998 年版)。功能与主治: 开郁行气，活血止痛。用于胸闷，气短，胸肋刺痛，“巴木病”［1］。成分: 据文献记载［2］，红花具有活血通经、散瘀止痛之功效，其查尔酮类成分羟基红花黄色素A、黄色素A 为活性成分。因此，为了考察该药的质量，本研究参照有关资料［3］建立了其有效成分羟基红花黄色素A 的HPLC 含量测定方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器: SHIMADZVLC -10Avp，LC -10ATvp 型泵，SCL-10Avp 型控制器，SPD-10AVP 型检测器，CLASS -VP 色谱工作站，岛津UA-1700 型紫外-可见分光光度计。

2.2 试药: 甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为高纯水，羟基红花黄色素A 对照品(购于中国食品药品检定研究院，批号: 111637 -201003)，样品由内蒙古中蒙医院提供。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件: 色谱柱: Diamonsil(钻石)C18 柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相: A: 甲醇-乙腈(19: 2)B: 0.7%磷酸溶液(以三乙胺调节pH 值至6.0 ±0.1)，A: B(23: 77);流速: 1.0 mL/min;柱温: 40℃;进样量: 20μL;检测波长为

403nm。

2.2 对照品溶液的制备: 精密称取羟基红花黄色素A 对照品适量，加25%甲醇制成每1mL 中含45μg 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备: 取本品约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇100mL，称定重量，超声处理(功率120W，频率40KHZ)40min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过微孔滤膜(0.45μm)，即得。

2.4 专属性考察: 取按处方比例并以相同工艺制备的缺红花的阴性对照，按供试品溶液制备法制得阴性对照品溶液。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，测得结果为: 供试品溶液中色谱峰保留时间与羟基红花黄色素A 对照品一致，且阴性供试品色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱相对应的保留时间处无干扰，表明该含量测定方法专属性好。(色谱图见图1、2、3)

2.5 线性关系考察: 取羟基红花黄色素A 对照品约3.0mg，精密称定，置50mL 量瓶中，加25%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密吸取1. 0、3. 0、5. 0、7. 0、9. 0、10.0mL，分别置10mL 量瓶中，加25%甲醇至刻度，摇匀，各吸取20μL 进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行回归分析，回归方程为Y=2935395X-20646 r=0.9998。结果羟基红花黄色素A在0.1304 ～1.304μg 范围内呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验: 取同一供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6 次，测定羟基红花黄色素A 峰面积积分值，RSD为1.02%。

2.7 稳定性试验: 取同一供试品溶液，室温放置(避光)，在上述色谱条件下，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h 进样测定羟基红花黄色素A 峰面积积分值，RSD 为0.96%。试验结果表明羟基红花黄色素A 在24h 基本稳定。

2.8 重复性试验: 取同一批号样品，平行制备6 份供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，RSD 为0.82%。

2.9 加样回收试验: 取已知含量的供试品6 份，各约0.5g，精密称定，分别精密加入羟基红花黄色素A 对照品适量，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，进样20μL，按上述方法测定每份含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.10 样品含量测定: 取3 批样品各2 份，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，并依法测定，3 批样品的测定结果分别为5.23mg/g、5.18mg/g、5.20mg/g。

3 讨 论

3.1 流动相的选择: 参照《中国药典》2010 年版一部“红花”项下的含量测定方法，以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26: 2: 72)为流动相进行测定，结果羟基红花黄色素A 与其它成分分离不好，峰型不对称，经试验摸索将流动项改为A: 甲醇-乙腈(19: 2)作为有机相，B: 0.7%磷酸溶液(以三乙胺调PH 至6.0 ±0.1)作为水相，通过不同比例比较试验，将流动相的比例为A: B(23: 77)时，样品中的羟基红花黄色素A 与其它成分均达到较好的分离(分离度为3.27)，峰型较好(拖尾因子1.09)，并具较适合的保留时间，故将流动相定为A: B(23: 77)。

3.2 柱温的选择: 参照《中国药典》2010 年版一部“红花”项下选择30℃柱温时，柱压偏高，测定成分与其它成分分离不好;柱温升高到40℃时使流动项粘度减小，柱压降低并改善分离效果，故将柱温定为40℃。

［1］卫生部药典委员会. 卫生部药品标准蒙药分册［S］.1998: 90.

［2］王宝琴.中成药质量标准与标准物质研究［M］.中国医药科技出版社，211.

［3］国家药典委员会. 中华人民共和国药典［S］. 一部. 北京: 中国医药科技出版社，2010