紫外可见分光光度法测定民族民间药山茶花中咖啡因的含量

孙 超 屈爱桃 李 洋 刘翔宇 牧 丹 于 西

(内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059)

山茶花(CameLLia japonica L.)为山茶科山茶属植物，始载于《本草纲目》，又名茶花，小茶花，山茶，耐冬等。具有抗癌、抗菌、抗骨质疏松及抑制心脑血管疾病等功效［1］。同时，山茶花味辛苦、凉，无毒，还具有凉血、止血、散瘀、消肿之功能，用于治疗吐血、血崩，肠风、血痢、血淋、跌扑损伤、烫伤等［2］。在寻找其药理作用的同时，对其进行化学成分研究时发现其含有大量咖啡因。因此，本实验利用紫外分光光度法对山茶花样品中咖啡因含量进行提取和含量测定。

1 仪器、药品和试剂

1.1 试验仪器: 圆底烧瓶(若干)、容量瓶200mL(若干)、容量瓶50mL(若干)、移液(若干)、量筒、铁架台等。ZKB-1 -4 型循环水多用真空泵(山东省鄄城华鲁电热仪器有限公司);紫外可见分光光度计(TU -1901，北京普析通用仪器有限责任公司);水浴锅(上海亚荣生化仪器厂);分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试验药品与试剂: 山茶花(不同批次，天立药业有限公司，经内蒙古医科大学药用植物教研室乔俊缠教授鉴定为山茶科山茶属山茶花);对照品: 咖啡因(上海试剂二厂)乙酸铅: 天津市化学试剂六厂(批号20091208);浓硫酸: 呼和浩特市化学试剂厂(批号XK13 -001 -0304009II);盐酸: 北京化工厂(批号20111209)。

2 方法与结果

2.1 咖啡因标准品溶液的制备: 精密称取咖啡因对照品5.00mg，置于100mL 容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，得到浓度为50μg·mL-1的咖啡因对照品溶液，备用。

2.2 测定波长的选择: 将紫外可见分光光度计的扫描波长定为200 ～400nm，取2 份蒸馏水样进行基线扫描，待基线平稳后，分别取供试品溶液和对照品溶液在紫外分光光度计上于200 ～400nm 波长处进行扫描，结果对照品与供试品溶液在273nm 处均有最大吸收，故确定273nm 为检测波长(图1，图2)。

3.3 标准曲线的绘制: 精密移取咖啡因对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL 的对照品溶液至25mL 容量瓶中，分别加蒸馏水定容至刻度，得到浓度分别为4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg·mL-1的咖啡因对照溶液见表1。对咖啡因的对照品溶液进行测定，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标得到咖啡因的浓度-吸光度标准曲线，回归方程为A =0.0502x-0.0011 ，r=0.9998，线性范围为4 ～20μg·mL-1，结果见图3。

表1 不同浓度咖啡因对照品溶液的吸光度

3.4 供试品提取条件的考察及结果分析: 为了确保提取质量，以控制样品咖啡因的含量为指标，选出提取时间，提取温度，料液比例3 个提取因素，每个因素3 个水平(表2)的L9(34)正交设计方案，经9 次试验得出最佳提取条件。

正交实验结果分析: 对正交试验有关数据作极差分析，结果见表2、3，影响因素中，提取温度影响最大、其次是料液比、提取时间影响最小，提取工艺各因素对咖啡因提取率影响程度依次为C3 ＞A3 ＞B2，因此，料液比为1: 150，提取时间为1.5h，提取温度为95℃时为山茶花中咖啡因提取的最优条件，为山茶花的供试品溶液制备提供了依据。正交设计及结果见表3。

表2 水平与因素

表3 正交试验L9(34)

3.5 供试品溶液的制备: 称取山茶花粉末约1.0g，精密称定。加150mL 蒸馏水于圆底烧瓶中在95℃水浴锅中加热1.5h，立即趁热抽滤，转移至200mL 容量瓶中并加蒸馏水至刻度，从容量瓶中精密吸取12.0mL 溶液，加入50mL 的容量瓶中，再向其中精密加入0.01mol HCl5.0mL 及50%的醋酸铅1.0mL，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置抽滤。在滤液中滴入3 滴浓硫酸，再次静置抽滤。精密吸取滤液25.0mL 转移至50mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，得供试品溶液。

3.6 方法学考察

3.6.1 稳定性试验: 精密吸取同一份供试品溶液，每隔2h测定其吸光度，观察吸光度的变化并记录数据，结果见表4。测定结果其RSD 为1.18%，说明该药品溶液在12h 内稳定。

表4 稳定性试验结果

3.6.2 精密度试验: 精密吸取供试品溶液5.0mL 到10mL的容量瓶中，定容，在最大波长处测定其吸光度，平行测定6 份，结果见表5。测定结果其RSD 为0.58%，说明实验精密度良好。

表5 精密度试验结果(n=6)

3.6.3 重现性试验: 对同一批样品分别制备样品供试液，测定并计算咖啡因含量，结果见表6，RSD 为1.67%。表明同批样品经多次测定，重现性良好。

表6 重现性试验结果(n=5)

3.6.4 回收率试验: 精密称取已知咖啡因含量的山茶花细粉(同一批次)0.5g，6 份，分别加入咖啡因标准品适量，按“3.5”方法平行制备。测定结果见表7。平回收率为100.9%，RSD 为1.06%，在有效范围内，说明该实验回收率较高［3］。

表7 加标回收率结果(n=6)

3.7 含量测定: 称取山茶花粉末约1.0g，精密称定。按“3.5 供试品溶液的制备”方法制备溶液，在测定波长处进行含量测定，依该法分别对3 批山茶花药材进行含量测定，得出的数据见表8。

表8 不同批次样品溶液的吸光度及咖啡因含量

3 讨 论

本试验所用山茶花已经确定含有咖啡因，对照品和供试品都在273nm 波长处有最大吸收，与文献基本一致［4］，所以确定供试品在273nm 的吸收峰为咖啡因的吸收峰。咖啡因在温度大于100℃时具有升华的性质［5］，所以对于试验温度应控制在100℃以下，所以参考文献选择了85℃，90℃，95℃三个温度进行正交试验，并通过试验确定最优温度为95℃。在对供试品溶液进行光谱扫描所得的曲线峰值均为268 ～274nm，说明干扰杂质已基本除去，不影响峰形，保证了检测结果的准确性。

本实验对山茶花中咖啡因的提取方法进行了研究，通过正交试验确定其最佳的提取条件，用此最优条件提取山茶花种的咖啡因进行含量测定实验，确定山茶花中咖啡因的含量。同时进行一系列的检测性试验，如精密度试验、重现性试验、稳定性试验及加样回收率实验，以确定此次试验的精确度及准确度。

山茶花作为民族民间药材可用于烫伤、止血与凉血作用［6］。而适量的咖啡因具有兴奋利尿作用，临床上用作利尿剂、强心剂和复醒剂，同时也是配制复方乙酰水杨酸和氨非咖片等的主要原料。本次试验对山茶花提取方法及咖啡因含量进行了测定，为深度开发山茶花药材资源提供依据。

［1］李斌，罗永明. 山茶属植物化学成分及生物活性研究［J］.江西中医学院学报，2000，12(1): 44 -47.

［2］江苏新医学院. 中药大辞典［M］. 上海: 上海科学技术出版社，2000.

［3］刘臣，唐长波，姚丽萍，等.高效液相色谱法测定碧螺春茶叶中的咖啡因含量［J］. 江苏农业学报，2012，28(4): 877 -879.

［4］杨言言，张铁铭.紫外分光光度法测定安徽罗汉尖老茶中咖啡因含量［J］.安徽中医学院学报，2012，31(3): 72-73.

［5］徐凤英.茶叶中咖啡因提取方法与工艺［J］. 宁夏农林科技，2012，53(11): 102 -103.

［6］任全进，于金平.止血凉血山茶花［J］. 植物与保健(冬末版)，2009.54 -55.