双光子共聚焦显微镜在植物学研究中获取高质量图像的应用

管利萍,赵 阳,彭 亮

(兰州大学生命科学学院,甘肃兰州 730000)

双光子共聚焦显微镜在植物学研究中获取高质量图像的应用

管利萍,赵 阳,彭 亮

(兰州大学生命科学学院,甘肃兰州 730000)

介绍了双光子共聚焦显微镜的基本原理和特点,从仪器操作、参数调节等方面记叙了利用双光子共聚焦显微镜FV1000 MPE在植物学研究中如何获取高质量图像的问题,旨在为该仪器的使用者与管理者提供参考,使之更好地服务于的教学与科研研究。

双光子激光共聚焦显微镜;荧光;图像

双光子共聚焦显微镜是集双光子和激光共聚焦显微镜为一体的扫描成像和分析系统,是生命科学领域大型实验平台,是重点实验室和科研院所必备的大型仪器,自二十世纪九十年代开发应用到现在,为生命科学众多领域的研究提供了强大的技术支持,成为高质量图像和数据信息采集的必备仪器。由于该仪器价格昂贵、管理要求严格,使用者必须系统地了解和掌握其使用和管理方法。

1 双光子共聚焦显微镜简介

激光共聚焦显微镜技术(laser scanning confocal microscope,LSCM)是光学显微镜技术的一次革命,对生命科学等相关学科的研究工作起到了不可估量的推动作用[1]。激光共聚焦显微镜,基本原理是Marvin Minsky于1957年提出的,它以激光作为光源,采用共轭聚焦技术消除焦点以外杂散光的干扰,配合光扫描技术实现对样品的光学切片和三维成像[2]。但由于其光毒害、光降解、光漂白等原因以及受到显微镜本身复杂的紫外光学元件的限制,LSCM的特点和潜力最初没有完全发挥出来[3]。1990年美国康奈尔大学Denk 等[4]将双光子激发现象应用到激光共聚焦扫描显微镜中,并制造出了第一台双光子激光共聚焦显微镜(Two-photon laser scanning microscope,TPLSM)。双光子技术多采用锁模的飞秒钛宝石激光器得到足够强的红外激光,红外激光具有相对较深的传播距离,不同于单光子激发的线性过程,双光子只在焦点处的微小区域内样品才能吸收双光子而发出荧光[5]。所以双光子技术问世后由于其低损伤、大成像深度、活体长时间三维成像和背景干扰极小,很快被用于神经信号传导、生物代谢和药物研究,近年逐渐成熟的双光子全内反射技术,更是将双光子高信噪比和实时动态成像等优点发挥到了极致[6-7]。

2 双光子共聚焦显微镜获取植物图像的操作

贵重大型仪器的使用从开机到使用,每一步都必须遵守严格的操作流程。如果不严格按照流程操作,轻者减少设备寿命,重者会直接造成设备损坏,所以操作者每一个步骤都要严格、细心执行。

2.1 开机

激光器等设备价格昂贵,开机前使用者要明确本次开机的工作目的,根据实验需求开启相应的激光器,避免打开不必要的设备而造成损耗和浪费。一般扫描植物材料不需要开启双光子激光器的电源和AOM装置电源。双光子进行活体动物扫描时使用的是长工作距离双光子专用水镜,配备的电动载物台固定在大型防震台上,而使用其他物镜进行共聚焦扫描时需要在电动载物台上安装便携式小载物台(见图1),否则无法对焦,所以在开机时需要特别注意如下问题:使用共聚焦扫描在打开软件前不能安装便携式小载物台,因为软件开启时自动恢复的是前次物镜的工作位置,如果前次使用者使用的是25×水镜,开启软件时系统自检到的是25×水镜的位置,物镜会自动下降到很接近电动载物台的位置,如果软件未打开前就安装上便携小载物台,就会发生软件启动时物镜碰撞到便携小载物台的危险。所以正确的做法是:打开电脑和设备电源,再打开软件,将物镜转换器升高到最高位置,清除原有双光子Z扫描的起止点数据,最后安装便携小载物台。

图1 双光子共聚焦显微镜FV1000 MPE的载物台

2.2 各参数调节

(1)图像采集的参数调节。选择合适的扫描速度,扫描速度一般在8～10之间,过慢易发生淬灭,过快则分辨率较低,背景噪影升高。扫描分辨率可根据需要在64×64～4096×4096间选择;图片实际分辨率与使用的物镜也有关,要选择合适的物镜,需用高倍物镜时就不能用低倍物镜代替;提高实际分辨率时还要注意数字放大ZOOM值不能过大,一般选择3～4, ZOOM过高则无意义。为提高信噪比可选择Kalman滤波器,一般情况下设置幅平均为2～6,实际操作中要根据材料的耐受性和实验目的合理选择。

(2)荧光检测通道的精细调节。针孔(pinhole)的调节:针孔的大小与物镜数值孔径有关,为保证图像质量,针孔值越接近1 Au(airy unit)则越好,熟练掌握软件的操作者可根据需要调节针孔大小。

激光管电压的调节:激光管电压越高,激光强度越强,收集的荧光信号也越强,但标本更容易漂白或淬灭,长时间高电压还会缩短半导体激光器寿命。FV1000 MPE的405 nm、635 nm激光器是半导体激光器,这2个激光器没有单独的电源控制开关,只要开启设备它们就已通电,所以为保证其使用寿命,这2个激光器使用结束后,一定要将它的激光强度降为0才能进行其他操作。总之,在保证图像质量的前提下,激光强度越低越好,且随着使用时间的推移,激光器功率会有所降低,所以在激光器使用一段时间后,同类实验材料根据实际情况可在以往基础上适当提高激光强度。

检测通道的调节:光电倍增管(PMT)的电压(HV)值越高,荧光信号越强,但过高的电压会缩短PMT的寿命,一般HV不超过800为宜;增益(Gain)增大则信号和噪声都增强,减小则信号和噪声都减小,原则上以图像质量为准,增益值越接近1越好;背景扣除(Offset)根据经验选择7～15较好。

可调光栏(VBF)的调节:VBF可对发射光接收范围进行调节,在扫描前实验者要明确所用的染料或探针的发射谱线,选择正确接收范围,避免噪声或串色[8]。

设置以上参数时应避免出现曝光过度和曝光不足,可适时点击ctrl＋F键检查曝光程度,以免影响图像质量和后续的数据分析[9]。

(3)XYZ扫描应注意的问题。FV1000 MPE可对样品进行连续分层扫描和三维重建。如需对样品结构进行三维重建,在扫描时要注意Z轴扫描深度为该样品Z轴深度的两倍,即扫描样品本身深度加样品上、下部二分之一Z轴深度,这在进行三维重建时不会丢失信息,且后期处理的效果会更好。还要注意步距(Z-steps),不同的结构需设置不同的步距,以原生质体为例,步距在0.5～0.8μm即可,细胞骨架步距在0.4～0.6μm,过小的步距不但无法实现预期目的,而且浪费时间和材料。还要注意排除一切引起水平和Z轴方向产生移动的因素,比如扫描时保持安静、人员不要来回走动、不能碰触防震台等。

3 双光子共聚焦显微镜在植物研究中获取高质量图像应用举例

3.1 拟南芥根尖

选取4～6天生长的根尖(成熟区根毛多不宜作为扫描区),临时装片加盖玻片时介质要适宜,液体偏少会产生较多的气泡,液体偏多容易出现流动,两者都会影响成像。扫描时选择4∶3模式,即扫描分辨率为1024×768,使用20×或40×复消色差物镜,ZOOM值为2～4,Kalman为2～4。如需进行Z扫描,步距为0.7～0.8μm,但层数不宜过多,否则影响合成效果。图2(a)为拟南芥根尖Z扫描合成图,步距0.7μm,4层合成,红色为PI染色,绿色表示生长素水平指示基因DR5的表达情况。

3.2 叶表皮

植物叶片上表皮由于具有较多的表皮毛会影响扫描,如果观察表皮细胞应将下表皮朝上。制备临时装片时叶龄要适宜,不宜太老,取材面积不宜过大[10],以小拇指甲面积的0.2～0.3为宜,铺平,扫描分辨率1024× 1024,40×复消色差物镜,ZOOM值为3～4,Kalman为2～3,需要Z扫描时步距根据材料确定,细胞骨架步距不超过0.6μm,其他步距0.7～0.8μm均可。图2(b)为拟南芥叶表皮Z扫描合成图,红色为FM4-64染色的细胞膜,绿色为GFP,步距0.7μm。图2(c)为拟南芥叶表皮示骨架Z扫描合成图,步距0.6μm。

3.3 原生质体

为防止由于液体流动发生图像飘移,可用加样枪吸取15μL左右的材料并制成临时装片,40×复消色差物镜,扫描分辨率为1024×1024,ZOOM值为4～8。由于激光刺激,单细胞更易在液体中移动或旋转而影响成像,因此可不使用Kalman。要获得立体感强的图片需要Z扫描,步距0.6～0.7μm,扫描速度不宜过慢。图2(d)和(e)为原生质体自发绿色和红色荧光图,图2(e)为通过VBF将自发绿色荧光去除采集到的GFP信号和叶绿体红色自发荧光,步距0.6μm,均采用Z扫描合成。

图2 双光子共聚焦显微镜获取的植物组织和细胞的图像

通过以上的技术和方法,我们已经为多个课题组获取了大量的高质量的图像,相关研究成果已经发表在《PLOS Genetics》[11]、《Plant Journal》[12]、《Plant Physiology》、《Molecular Plant》[13]等10余种国际高水平SCI期刊,得到了广大师生的充分肯定和欢迎。

4 结束语

随着激光成像技术、计算机技术的发展,双光子共聚焦系统的应用水平会得到更大的提升。同时,要开发利用好该仪器,要求仪器管理者具备强烈的责任心[14],坚持做到仪器设备的日常维护和定期保养,完善使用制度,不断提高自身业务水平和工作积极性[15-16]。管理者还可以通过开设研究生课程等方式对使用者进行系统的培训,开通网上预约系统,以便更好地为师生和科研工作者服务。

References)

[1]Cannon J,Armas M.Laser Focus World,Ultraviolet lasers expand uses of confocal microscopes[J].Laser Focus World,1993,29: 99-104.

[2]王春梅.激光扫描共聚焦显微镜技术[M].西安:第四军医大学出版社,2004.

[3]陈德强,夏安东.双光子激光扫描荧光显微镜及其应用[J].物理, 2000,29(4):232-236.

[4]Denk W,strickler J H,Webb W W.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy[J].Science,1990,248:73-76.

[5]Svoboda K,Denk W,Kleinfield D,et al.In vivo dendritic calaium dynamics in neocortical pyramidal neurons[J].Nature,1997,385: 161-165.

[6]夏伟强,周源.双光子显微成像技术的新进展[J].中国医疗器械杂志,2011,35(3)204-207.

[7]Schapper F,Gonslves J T,Oheim M.Fluorescence imaging with two-photo evanescent wave excitation[J].European Biophysics Journal,2003,32:635-643.

[8]段妍,关苑君.Zeiss LSM710激光共聚焦显微镜的使用和管理[J].实验室研究与探索,2012,31(8)228-230.

[9]袁兰,激光扫描共聚焦显微技术教程[M].北京,北京大学医学出版社,2004.

[10]刘向东.利用激光扫描共聚焦显微镜研究植物细胞发育形态学变化[J].激光生物学报,2007,16(2)173-178.

[11]Qin Q Q,Wang W,Guo X L,et al.Arabidopsis DELLA protein degradation is controlled by a type-one protein phosphatase, TOPP4[J].PLOS Genetics,2014,10(7):e1004464.

[12]Qian P P,Han B,Forestier E,et al.Sterols are required for cell fate commitment and maintenance of the stomatal lineage in Arabidopsis[J].The Plant Journal,2013,74:1029-1044.

[13]Zhu J,Yuan S,Wei G et al.Annexin5 is essential for pollen development in Arabidopsis[J].Molecular Plant,2014,4:751-754.

[14]习晓远,袁庆祝.实验队伍与实验室可持续发展的研究[J].实验技术与管理,2000,17(5):67-69.

[15]董伟,刘瑾.加强大型仪器设备科学化管理,提高使用效益[J].实验技术与管理,2008,25(4):173-175.

[16]杨威.提高大型仪器设备的综合管理水平[J].实验技术与管理, 2012,29(2):200-202.

Application of two-photon confocal microscopy in botany research for high quality images

Guan Liping,Zhao Yang,Peng Liang
(School of Life Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

As a widely used large and expensive equipment in the life science field,the two-photon confocal microscope has been used in the research of botany,zoology,molecular cell biology,neurobiology,genetics and biological medicine.This study discusses the key problems in actual operation and daily maintenance of this equipment in botany research and provides a good reference for its users and managers,which can improve the use ful efficiency of the equipment for teaching and research in universities.

two-photon laser scanning confocal microscope;fluorescence;image

Q-336

B

1002-4956(2015)4-0044-03

2014-012-25修改日期：2015-01-04

兰州大学实验技术创新基金项目(234820911)资助

管利萍(1971—),女,甘肃兰州,硕士,实验师,主要从事双光共聚焦显微镜的操作与管理.

E-mail:guanlp＠lzu.edu.cn