丁苯酞对血管性痴呆大鼠记忆功能及海马神经元代谢产物的影响

孙晓鸣,鲍君杰,张华,赵合庆,张彩元,朱莉萍

(1.苏州大学附属第二医院 药剂科，江苏 苏州 215000；2.苏州大学附属第二医院 神经内科，江苏 苏州 215000；3.苏州大学附属第二医院 磁共振室，江苏 苏州 215000；4.华中科技大学 基础医学系，湖北 武汉 430000)



丁苯酞对血管性痴呆大鼠记忆功能及海马神经元代谢产物的影响

孙晓鸣1,鲍君杰1,张华1,赵合庆2,张彩元3,朱莉萍4

(1.苏州大学附属第二医院 药剂科，江苏 苏州 215000；2.苏州大学附属第二医院 神经内科，江苏 苏州 215000；3.苏州大学附属第二医院 磁共振室，江苏 苏州 215000；4.华中科技大学 基础医学系，湖北 武汉 430000)

目的 探究丁苯酞(3-N-butylphthalide，NBP)对血管性痴呆(vascular dementia，VD)大鼠学习记忆功能及海马神经元代谢产物的影响。方法 90只健康雄性SD大鼠，随机选取10只为假手术组，其余80只用2VO法制作大鼠VD模型。术后8周共存活48只大鼠，随机分为VD模型组、NBP低剂量组、NBP中剂量组、NBP高剂量组4组，每组各12只。术后8周NBP低、中和高剂量组大鼠分别腹腔注射NBP12.5、25和50 mg/(kg·d)，VD模型组和假手术组则注射相同体积的0.5%Tween-80溶液，所有大鼠均连续注射4周。采用定位航行试验和空间探索试验考察各组大鼠行为学变化，1H-MRS法检测神经元代谢产物变化。结果 定位航行试验结果表明大鼠的学习记忆能力与DBP剂量成正比，即1～5 d，NBP中、高剂量组的平均逃离潜伏期低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，空间探索试验结果表明DBP高剂量组能够显著改善大鼠学习记忆能力；1H-MRS检测结果表明与给药后VD 模型组相比，NBP中、高剂量组NAA/Cr、Cho/Cr和mI/Cr与模型组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)，表明中、高剂量NBP对海马内神经胶质细胞的增生有明显促进作用，而NBP低剂量组则无明显作用。结论 丁苯酞可以对血管性痴呆模型大鼠的学习记能力起到改善作用，通过调节海马神经元代谢产物，达到改善VD作用。

丁苯酞；血管性痴呆；水迷宫；海马神经元代谢

脑血管疾病在我国已成为造成死亡的第一杀手[1]，它引起的脑卒中通常能在很短时间内导致血管性痴呆(vascular dementia，VD)的发生[2]。丁苯酞(3-N-butylphthalide，NBP)，又称芹菜甲素，化学名消旋-3-正丁苯酞，是我国自主研制的国家一类新药[3-4]，它提取自天然植物水芹菜籽并消旋合成为黄色油状液体，具有良好的抗缺血作用，是一种对防治VD具有很好应用前景的新药之一[5-6]。它通过保护缺血脑组织、减轻脑水肿，改善脑能量代谢、改善缺血脑区的微循环，抑制神经细胞凋亡，抗脑血栓形成、抗血小板聚集作用，抑制炎症损伤，抑制谷氨酸释放，抑制细胞内钙超载，抑制自由基和提高抗氧化酶活性等机制而发挥药物疗效[7]。目前对NBP的研究多集中在抗脑缺血领域，但它对VD 的相关治疗作用尚未十分明确[8]。本实验主要通过NBP对VD 大鼠学习记忆功能的考察，1H-MRS评估VD 大鼠海马内代谢物的变化进行探讨，以期为临床治疗VD 提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：90只健康雄性SPF级SD大鼠，体质量200～250 g，由武汉大学动物实验中心提供，经湖北省实验动物质量检测站检测合格，实验动物合格证编号为：No.4200592799。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.1.2 药品与试剂：NBP原液(石家庄药业集团恩必普药业有限公司提供)，临用前以0.5%Tween-80 配成乳剂。注射用青霉素钠(悦康药业集团北京凯悦制药有限公司)；吐温80(上海广诺化学科技有限公司)；水合氯醛(上海化学试剂采购供应五联化工厂)；3%～5%苦味酸溶液(深圳三利化学品有限责任公司)；无水乙醇，4%的戊二醛溶液(天津市凯通化学试剂有限公司)；4%多聚甲醛溶液(武汉谷歌生物科技有限公司)；伊红、苏木精、石蜡、二甲苯、PBS缓冲液、锇酸、丙酮和柠檬酸铅(广州化学试剂厂)；中性树胶(北京康为世纪生物科技有限公司)；磷酸氢二钠(天津市永生化工有限公司)；磷酸二氢钠(天津市博迪化工有限公司)；PON 812环氧树脂(北京中镜科仪技术有限公司)。

1.1.3 仪器P：7.0 T 磁共振波谱仪 BioSpec70/20(德国Bruker 公司)；Morris 水迷宫(苏州大学附属第二医院提供)；SMART 行为学视频分析软件(西班牙Pa NBP高剂量ab公司)；XYC型鼠断头器(淮北正华生物仪器设备有限公司)；精度在0.01 mg的电子天平(上海精密仪器实验设备有限公司)；Milli-Q6型超纯水系统(美国MJ Research公司)；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱(上海精密仪器实验设备有限公司)；DSHZ-300型恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 分组：90只健康雄性SD大鼠，随机抽出10只为假手术组，其余80只用2VO法[12]制作大鼠VD模型。其中假手术组大鼠只分离双侧颈总动脉而不结扎，其余4 组均行双侧颈总动脉结扎。术后8周共存活48只VD模型大鼠，再将其随机分为4组：VD模型组、NBP低剂量组、NBP中剂量组、NBP高剂量组，每组各12只。

1.2.2 给药：术后8周开始腹腔注射给药。NBP用0.5%Tween-80助溶，配制成浓度为10 mg/mL的溶液。NBP低剂量组、中剂量组和高剂量组的注射剂量分别为12.5、25、50 mg/(kg·d)，VD模型组和假手术组则注射相同体积的0.5%Tween-80溶液，所有大鼠均连续注射4周。

1.2.3 检测指标：行为学测试[3]：腹腔注射给药4周后，用Morris水迷宫进行定位航行试验和空间探索试验，记录前5 d的逃避潜伏期和第6天的跨越原平台位置次数。

1H-MRS检测[7]：大鼠的1H-MRS检测在中国科学院武汉物理与数学研究所进行。检测分2个时间点进行，第1个时间点为术后8周进行腹腔注射给药之前，第2个时间点为行为学检测结束后1周。检测大鼠海马区NAA、Cr、Cho、mI峰的积分面积，并计算NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr的比值。

2 结果

2.1 定位航行试验结果 与VD模型相比，1～5 d，假手术组，NBP中、高剂量组之间的平均逃离潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)，而NBP低剂量组无统计学意义；1～5 d，NBP高、中和低剂量组之间平均逃离潜伏期表现为随着剂量的增加，平均逃离潜伏期缩短，即NBP高剂量组的平均逃离潜伏期最短。见表1。

表1 各组大鼠定位航行试验结果±s)Tab.1 Result of place navigation ±s)

*P<0.05，与VD模型组相比，compared with VD model group

2.2 空间探索试验结果 与VD模型组相比，假手术组，NBP中、高剂量组之间跨越原平台位置次数差异有统计学意义(P<0.05)，且跨越原平台位置的次数表现为随着剂量的增加，跨越原平台位置的次数增多，即NBP高剂量组的跨越原平台位置的次数最多。表明大剂量NBP治疗对VD 大鼠的空间记忆能力有比较明显的改善效果。见表2。

表2 各组大鼠跨越原平台位置次数±s，次)Tab.2 The number of crossing the original platform of each ±s，times)

*P<0.05，与VD模型组相比，compared with VD model group

2.3 大鼠海马的1H磁共振波谱的检测 与给药前相比，VD模型组给药后的NAA/Cr显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明海马神经元的功能随着缺血时间的持续进一步下降；Cho/Cr升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明海马内仍有细胞损伤发生；mI/Cr差异无统计学意义，表明海马内神经胶质细胞增生不明显。见表3。

表3 VD模型组给药前后NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr比较Tab.3 Comparison of NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr in model group before and after ±s)

*P<0.05，与给药前VD模型组相比，compared with model group before treatment

与给药后VD模型组相比，假手术组与NBP中、高剂量组之间的NAA/Cr、Cho/Cr和mI/Cr差异有统计学意义(P<0.05)，而NBP低剂量组无显著统计学意义。表明中剂量组和高剂量组对海马内神经胶质细胞的增生有明显促进作用，而NBP低剂量组则无此作用，见表4。

表4 各组NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr的比较Tab.

*P<0.05，与给药后VD模型组相比，compared with VD model group after treatment

2.41H-MRS检测NAA、Cho和mI与Cr的质谱图 给药前大鼠1H MRS的Cho、NAA、Cr的波峰高耸，Glx及mI的波峰略低，Lac波峰低平，给药以后NAA峰明显下降，Lac波峰明显增高呈典型的倒置双峰状。

图1 给药前和给药后NAA、Cho和mI与Cr的质谱图Fig.1 Mass spectrogram of NAA，Cho and mI and Cr administration before and after drug administration

3 讨论

Morris水迷宫试验广泛应用于研究动物的行为学表现[9]。近年来有学者研究发现通过Morris水迷宫实验的训练对大鼠的学习和记忆能力有所提高，但重复性的Morris水迷宫训练却只会对提高大鼠的空间学习能力有帮助而对提高大鼠的空间记忆能力没有明显作用[10]。通过这一发现对动物的行为学研究有着重要的启示，看来只有当外界的刺激能够影响到动物的空间记忆能力的时候，才会对动物的长期行为产生直接的影响，换而言之空间记忆有助于产生长期记忆效果。

NAA主要存在于神经元及轴索中，是目前波谱研究中最重要的神经元标志物之一，其含量的变化可反映神经元的功能状况，其浓度下降确实伴有神经元的损伤，是神经元功能受损的标志[11]。也有相关研究证实，中心区域NAA含量的减少可作为脑梗塞发生的标志[12]。Cho主要来源于脑内磷酸胆碱和磷脂酰胆碱等胆碱物质的代谢产物，此类物质主要参与细胞膜的构成，故Cho含量的改变可反映细胞膜的合成与代谢变化。脑缺血时Cho和NAA的峰值都会降低，但Cho减少不如NAA显著[13]。目前普遍认为Cho峰的变化是在MRS上用于鉴别脑梗塞与恶性脑肿瘤的标志[14]。mI只存在于神经胶质细胞内，被认为是神经胶质细胞的标志[15]，mI含量的变化可反映神经胶质细胞的增生情况，是神经恢复的主要表现之一。

在本研究中，在造模8周后，VD模型组NAA含量较假手术组有明显下降，其降幅相比Cr和Cho更大。行大鼠NBP腹腔注射4周后再次行各组的MRS检查发现模型对照组和用药前NAA峰值相比有所下降，说明VD模型的神经功能有进一步下降。NBP小剂量组的NAA峰也和VD模型组区分不大，但NBP中剂量和高剂量组的NAA峰明显回升。又因为NAA是反映神经功能的标志，说明足量NBP对神经功能的恢复和保护有一定的作用。本研究中VD模型组和NBP低剂量组NAA/Cr确实比Cho/Cr要大，与上述报道一致的[13]。由于大多数脑肿瘤的MRS表现为NAA峰的降低，并且随着肿瘤恶性程度的升高也可能出现Lac峰，但Cho峰的表现却是增高的，在临床上鉴别脑梗塞与脑肿瘤需要将Lac峰和Cho峰结合起来分析，同时可以把出现Lac峰，而Cho峰无明显变化或降低作为MRS超早期诊断脑梗死的标准。在本研究中，给药后VD模型组与假手术组相比mI增高了，说明神经组织自身恢复时有神经胶质细胞增生，NBP中剂量组和高剂量组与给药后VD模型组相比，mI明显增高，说明足量的NBP可以明显促进神经胶质细胞增生。

综上所述，NBP可以对血管性痴呆模型大鼠的学习记忆能力起到改善作用，调节海马神经元代谢产物，以达到改善VD的作用。

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(编校：王冬梅)

Effect of butylphthalide on memory function and hippocampal neuronal metabolites in vascular dementia rats

SUN Xiao-ming1,BAO Jun-jie1,ZHANG Hua1, ZHAO He-qing2ZHANG Cai-yuan3,ZHU Li-ping4

(1.Department of Pharmacy, The Second Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215000, China; 2.Department of Internal Medicine-Neurology, The Second Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215000, China; 3.MRI Room, The Second Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215000, China; 4.Department of Basic Medicine, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, China)

ObjectiveTo explore the hippocampal metabolic changes of butylphthalide intervened vasculardementia (VD) rats and the functions of butylphthalide on learning and memory improvement.Methods10 rats were randomly selected from 90 healthy male SD rats to be sham operation group,and the remaining 80 rats were given 2VO surgery to make VD models.48 rats survived after 8 weeks, and then randomly divided into 4 groups: VD model group,NBP low,medium,high dose group,each had 12 rats.Rats of NBP low,medium,high dose group were injected NBP 12.5,25,50 mg /(kg·d), respectively.VD model group and sham operation group were injected with the same volume of 0.5% Tween-80 solution, all rats were continuous injection of 4 weeks.Behavior test was investigated by place navigation test and spatial probe test.Changes of neuronal metabolites were detected by1H-MRS.ResultsBehavior test results indicated that rats’ learning and memory ability were proportional to the DBP dose: 1～5 days, the average escape latency in NBP medium, high dose group were significantly lower than model group (P<0.05),and spatial probe test results indicated that DBP high dose group could significantly improve the learning ability of rats;1H-MRS detection results showed that compared with after administration of VD with those in the model group, NAA/Cr, Cho/Cr and mI/Cr in medium dose group and high dose group, the differences were statistical significance (P<0.05),but no statistical significance in NBP low dose group.The results indicated that the middle dose group and high dose group of glial cells in hippocampus hyperplasia had obvious effect, and low dose NBP group had no obvious effect. ConclusionButylphthalide can improve the ability of learning and memory in rats with vascular dementia, and regulate hippocampal neuronal metabolites to improve function of VD.

butylphthalide;vascular dementia;water maze;hippocampal neuronal metabolites

2009博士点基金(20090142120015)

孙晓鸣，女，本科，主管药师，研究方向：药剂科药品研究，E-mail:qch18214600108@163.com。

R74

A

1005-1678(2015)02-0084-04