miR-18a和雌激素受体α在单发及多发子宫肌瘤中的表达

廖治，肖洪涛

(1.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 妇产科，四川 成都 610072；2.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 药学部，四川 成都 610072)



miR-18a和雌激素受体α在单发及多发子宫肌瘤中的表达

廖治1，肖洪涛2

(1.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 妇产科，四川 成都 610072；2.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 药学部，四川 成都 610072)

目的 检测单发及多发子宫肌瘤组织中miR-18a及雌激素受体α(estrogen receptor alpha，ERα)的表达，探讨miR-18a与ERα的关系及2者在单发及多发子宫肌瘤发生中的作用。方法 采用原位杂交法检测miR-18a在单发及多发子宫肌瘤组织石蜡切片中的表达；采用免疫组化法检测ERα在单发及多发子宫肌瘤组织石蜡切片的表达。采用相关分析研究miR-18a和ERα的表达相关性。结果 多发子宫肌瘤组织中的ERα表达水平均明显高于单发子宫肌瘤组织(P<0.05)；但miR-18a水平明显低于单发子宫肌瘤组织(P<0.05)；相关分析结果表明，2者表达呈负相关(r单发=-0.4421，r多发=-0.4181)。结论 多发性子宫肌瘤中miR-18a的表达更低，ERα表达更高。miR-18a可作为治疗多发性子宫肌瘤的新靶标。

miR-18a；雌激素受体α；多发子宫肌瘤；单发子宫肌瘤

子宫肌瘤是妇科常见良性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，但其病因、发病机制至今尚未完全明了。目前认为子宫肌瘤是一种激素依赖性良性肿瘤，在子宫肌瘤生长过程中，雌激素、孕激素的细胞作用主要为诱导转录、合成调节、分化蛋白质，而这一作用是雌、孕激素通过作用于靶器官内的雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptors，PR)产生的。人的ER有2种亚型即ERα和ERβ，ERα作为雌激素受体之一对子宫肌瘤的发生发展起到关键作用。临床上常见的肌瘤以多发性子宫肌瘤为主，但也有一部分单发性子宫肌瘤。以往分子生物学研究结果提示[1-3]，单发性子宫肌瘤是由单克隆平滑肌细胞增殖而成；多发子宫肌瘤是由不同克隆细胞形成；但是在分子及体液机制下是否有其他的调控异常，目前尚不明确。

microRNA(miRNA)是一种广泛存在于真核生物细胞中的非编码单链小分子RNA，参与多种肿瘤的发生、发展及转移过程[4]，并与肿瘤的预后密切相关，是肿瘤早期诊断及判断预后的良好指标[5-6]。miR-18a的表达异常在肝细胞癌、结肠癌、妊娠期高血压疾病等多种疾病中得到证实。研究发现在疾病发生发展过程中miR-18a与ERα之间有靶向调节关系[7-9]。

本课题组之前的研究表明[10]，ERα可能是miR-18a的靶基因之一，ERα在子宫肌瘤中的高表达是由于miR-18a的下调引起的。miR-18a和ERα与子宫肌瘤发病具有一定的相关性。为进一步了解miR-18a和ERα在单发及多发子宫肌瘤中的表达差异，以探索可能的作用机制，本文旨在检测miR-18a和ERα在单发及多发中的表达，探讨2者相关性，为治疗子宫肌瘤提供新的依据和线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选择四川省人民医院2014年1月～2014年7月因子宫肌瘤入院行子宫全切或肌瘤挖除术的患者60例，其中单发性子宫肌瘤30例，多发性子宫肌瘤(≧2个)30例，患者平均年龄(40.2±4.5)岁；取样的子宫肌瘤直径均>5 cm，取其切除的肌瘤组织的病理存档蜡块。入选患者术前3个月内未服用任何激素类药物，未合并其他疾病，术后病理诊断均为子宫平滑肌瘤。

1.2 主要实验试剂 Has-miR-18a miRCURY LNA Detection probe、地高辛(DIG)标记LNA-miR-18a均购自Exiqon公司；兔抗人ERα(Millipore)、羊抗兔Ⅱ抗(Abcam)购自Abcam公司；SP免疫组化染色试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒、抗原修复液均购自成都正能生物技术有限公司；无水乙醇、多聚甲醛、苏木素为国产分析纯。

1.3 方法 全部标本均为10%福尔马林固定、石蜡包埋的子宫肌瘤组织标本，切片厚4 μm。

1.3.1 原位杂交检测miR-18a的表达：取石蜡包埋组织去石蜡、水化、柠檬酸盐抗原修复，49.5 ℃，杂交缓冲液中预杂交2 h，加入DIG labeled miRCURYTMprobes过夜。加入HRP标记的抗地高辛抗体(1:200)，4 ℃孵育过夜。TBST冲洗，在暗室中加染色溶液，孵育24 h。当达到期望的亮度时，将载玻片移至终止液(1 mM EDTA-PBS溶液)终止反应，苏木素复染。

1.3.2 免疫组织化学法检测ERα的表达：石蜡组织块脱蜡、水化后，微波处理使抗原激活。按照抗体说明书要求加入抗体，二氨基联苯胺(DAB)显色。阳性结果呈棕黄色。

1.4 结果判定标准 原位杂交及免疫组织化学结果应用Image-Pro Plus(IPP )软件进行分析，测量平均光密度(即时IOD/area)；根据胞浆阳性细胞数以及染棕黄色及黄色数的多少来划分等级，染色分布弥散且阳性细胞>50%为强阳性(+++)，阳性细胞为25%～50%为阳性(++)，阳性细胞10%～25%为弱阳性(+)，阳性细胞<5%或不染色为阴性(-)。

2 结果

2.1 miR-18a在单发及多发子宫肌瘤平滑肌细胞中的表达 原位杂交结果显示，miR-18a在单发及多发子宫肌瘤平滑肌细胞中均有表达，miR-18a阳性表达定位于细胞核内，为棕黄色染色，见图1。多发子宫肌瘤肌细胞中miR-18a平均光密度为82.38±4.26，显著低于其在单发子宫肌瘤肌细胞中的表达，为95.11±3.56，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 miR-18a在多发子宫肌瘤(A)和单发子宫肌瘤(B)中的表达(×200)Fig.1 Expression of miR-18a in multiple uterine fibroids(A) and single uterine fibroids(B) (×200)

2.2 ERα在单发及多发子宫肌瘤平滑肌细胞中的表达 ERα在单发及多发子宫肌瘤平滑肌细胞中均有表达，ERα阳性表达定位于细胞核内，为棕黄色染色，见图2。多发子宫肌瘤肌细胞中ERα表达水平的平均光密度值为354.47±18.57，显著高于其在单发子宫肌瘤肌细胞中的平均光密度值322.15±24.1，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 ERα在多发子宫肌瘤(A)和单发子宫肌瘤(B)中的表达(×200)Fig.2 Expression of ERα in multiple uterine fibroids(A) and single uterine fibroids(B) (×200)

2.3 子宫肌瘤中miR-18a表达与ERα表达的相关性 miR-18a与ERα在单发及多发子宫肌瘤中的表达均呈负相关(r=-0.4211，P<0.05；r=-0.4181，P<0.05)。见表1、表2。

表1 miR-18a与ERα在单发子宫肌瘤中的计数表达(n=30)Tab.1 miR-18a and ER alpha count in single uterine fibroids(n=30)

*P<0.05

表2 miR-18a与 ERα在多发子宫肌瘤中的计数表达(n=30)Tab.2 miR-18a and ER alpha count in multiple uterine fibroids(n=30)

*P<0.05

3 讨论

子宫平滑肌瘤是雌激素依赖性疾病，已有研究证实肌瘤组织中ER、mRNA表达成倍增加，雌激素通过其受体ERα和ERβ发挥生物学效应，子宫肌瘤的发生与患者局部内分泌环境异常有关，在女性子宫中以ERα为主[11]，尽管外周血中雌激素水平相似，但是局部组织受体密度可能决定其最终效应。ERα作为雌激素受体之一对子宫平滑肌瘤的发生、发展起到关键作用。

miRNA广泛参与了人类及各种生物的生理病理过程，肿瘤的发生中miRNA也起着重要的作用。有关子宫肌瘤发生中miRNA的报道最早见于2007年，一个miRNA可以调节多个靶基因的表达，几种miRNA也可以共同调控一个靶基因的表达。miRNA主要通过与靶mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)互补配对而负调控基因表达，当miRNA和目的mRNA完全互补时，降解目的mRNA；当不完全互补时，则负向调控翻译过程，阻碍蛋白质翻译[12-13]。在子痫前期孕妇胎盘组织中发现miR-18a的病理性低表达[14-16]，并且初步预测出其靶基因是ERα。但在子宫肌瘤中这2者的相关性研究仍然较少。本课题组之前的研究发现，miR-18a在子宫肌瘤中表达下降，ERα则在肌瘤组织中高表达。且在同一位患者样本中，miR-18a在子宫肌瘤组织中低表达，而ERα在肌瘤组织中高表达，表明2者之间存在负向调节。这种负向调节暗示ERα可能是miR-18a的靶基因之一，即ERα在子宫肌瘤中的高表达是由于miR-18a表达下调引起的。因此miR-18a和ERα与子宫肌瘤发病存在一定的联系。

本研究分单发及多发子宫肌瘤2组，且肌瘤直径均在5 cm以上，结论提示多发子宫肌瘤的ERα表达水平均明显高于单发子宫肌瘤，但miR-18a水平则比单发子宫肌瘤组织中的表达弱；同一肌瘤组织中这2者表达呈负相关。说明多发性子宫肌瘤中miR-18a的缺失更明显，可能导致多发肌瘤中ERα表达水平进一步增加。ERα的增多放大了雌激素的作用，肌瘤局部的“高雌激素受体环境”加速了靶细胞分裂、增殖，可能启动了子宫肌瘤的发生且同时导致肌瘤多发；而其上游调控基因miR-18a通过影响ERα表达参与子宫肌瘤的发生发展过程。

本研究结果表明miR-18a可能成为治疗子宫肌瘤的新靶标，为揭示其发病分子机制和治疗子宫肌瘤提供了新线索。但miRNAs作为基因调控机制中一个新成员，其具体调控机制还有待进一步研究，这将是下一步研究的方向。

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(编校：吴茜)

MiR-18a and estrogen receptor alpha expression in single and multiple uterine fibroids

LIAO Zhi1, XIAO Hong-tao2

(1 Department of Gynecology and Obstetrics, Hospital of the University of Electronic Science and Technology of China, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China;2.Department of Pharmacy, Hospital of the University of Electronic Science and Technology of China, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China)

ObjectiveTo detect the expression of miR-18a and estrogen receptor alpha (ER alpha) in single and multiple uterine flesh tumor tissues, discuss the relationship between miR-18a and ER alpha, and their effect in single and multiple uterine fibroids.MethodsThe expression of miR-18a and ER alpha in single and multiple uterine fibroids tissue paraffin section were detected by in situ hybridization method and immunohistochemical method, respectively.And the correlation between the miR-18a and ER alpha were evaluated.ResultsThe expression of ER alpha in multiple uterine fibroids group was significantly higher than that of single uterine fibroids tissues (P<0.05); while miR-18a was weaker than that of single uterine fibroids tissues(P<0.05).The correlation results showed that miR-18a expression was correlated negatively with ER alpha expression either in single(r=-0.4421) and multiple uterine fibroids(r=-0.4181).ConclusionThe expression of miR-18a is low in multiple uterine fibroids, while ER alpha had high expression.miR-18a could bea new target for the treatment of multiple uterine fibroids.

miR-18a; estrogen receptor alpha.multiple uterine fibroids; single uterine fibroids

四川省卫生厅项目(100491，120111)，四川省人民医院青年基金(30305030606，30305030859)；四川省科技厅项目(2014FZ0103，2015JQO027，2015ZR0160)

廖治，女，硕士，副主任医师，研究方向：妇产科，E-mail：liaozhi130@163.com；肖洪涛，通讯作者，男，博士，副主任药师、副研究员，研究方向：临床药理学，E-mail：xht927@163.com。

R737

A

1005-1678(2015)09-0054-03