黄芪多糖对大鼠急性放射性肺损伤的治疗作用

张海静，胡兆秋，孙玉卿，冯占芹，商洪才，张维芬,Δ

(1.潍坊医学院 临床学院，山东 潍坊 261042；2.潍坊市第二人民医院，呼吸与危重症医学科 山东 潍坊261041；3.潍坊医学院 药学院，山东 潍坊 261042；4.北京中医药大学东直门医院 中医内科学教育部重点实验室，北京 261053)



黄芪多糖对大鼠急性放射性肺损伤的治疗作用

张海静1†，胡兆秋2†，孙玉卿1，冯占芹3，商洪才4，张维芬3,4Δ

(1.潍坊医学院 临床学院，山东 潍坊 261042；2.潍坊市第二人民医院，呼吸与危重症医学科 山东 潍坊261041；3.潍坊医学院 药学院，山东 潍坊 261042；4.北京中医药大学东直门医院 中医内科学教育部重点实验室，北京 261053)

目的 探讨黄芪多糖对大鼠急性放射性肺损伤的治疗作用。方法 48只Wistar大鼠随机分成正常组、模型组、黄芪多糖组、地塞米松组，每组12只。后3组大鼠采用6MV-X 线直线加速器对大鼠双肺进行照射(20 Gy/次)造模，随后分别给予0.9%氯化钠注射液、黄芪多糖(8 mg/mL)和地塞米松(0.05 mg/mL)持续灌胃治疗8周，正常组佯装照射，给予生理盐水灌胃于放疗后2、8周，每组随机抽取6只大鼠处死，心脏取血进行白细胞、红细胞计数；取各组大鼠右上肺组织，HE染色观察病理改变。结果 成功构建了放射性肺损伤大鼠模型，一般情况观察显示：照射后的大鼠陆续出现精神萎靡，活动量减少、弓背、脱毛等症状，黄芪多糖及地塞米松处理后的大鼠与模型组比较，脱毛等现象逐渐改善。正常组未见任何明显异常变化。与正常组比较，模型组大鼠血液中白细胞及红细胞计数明显降低(P<0.05)，肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白细胞及红细胞明显升高(P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组与黄芪多糖组血液中白细胞及红细胞计数明显回升(P<0.05),且BALF中红细胞及白细胞明显降低(P<0.05)；但黄芪多糖组与地塞米松组比较差异无统计学意义。肺组织病理学显示：模型组较正常组大鼠，肺泡壁破裂、肺泡间隔增宽、肺间质增生、肺泡腔及肺间质有大量炎性细胞渗出；地塞米松组及黄芪多糖组大鼠均较模型组明显减轻，但2者之间差异无统计学意义。结论 黄芪多糖能显著改善大鼠急性放射性肺损伤，作用与地塞米松相近，为放射性肺损伤提供了治疗新方法。

放射性肺损伤；黄芪多糖；炎症细胞；肺泡灌洗液

放射性肺损伤(radio-pulmonary lesion)是胸部恶性肿瘤放射治疗常见的并发症，严重影响患者的生活质量并制约着放射剂量的提高[1-2]。目前对于放射性肺损伤的预防和治疗除物理防护措施外，主要侧重于药物治疗，临床上以糖皮质激素为主，但由于应用时间长，存在较多不良反应。因此，寻求理想的药物用于治疗放射性肺损伤成为当今研究的热点之一[3]。黄芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是黄芪的主要活性成分之一，主要作用为增强人体的免疫力，并且具有抗衰老、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等功效[4-5]，现已广泛应用于临床，其是否能作为治疗放射性肺损伤的新型药物，对此目前的相关研究甚少。本实验旨在建立放射性肺损伤模型，观察放射性肺损伤大鼠的外周血象及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中白细胞及红细胞计数和肺组织病理学变化来探讨黄芪多糖对放射性肺损伤的治疗作用，进一步明确APS对放射性肺损伤大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:健康Wistar大鼠48只，体质量150～200 g，雌雄各半，来自山东鲁抗动物中心，动物合格证号为：SLXK鲁2014002号。

1.1.2 药品：黄芪多糖(武汉胜天宇科技有限公司，批号20110506)，戊巴比妥钠(瑞尔欣德，批号69020100)，地塞米松(郑州市卓峰制药有限公司，批号13010326)。

1.1.3 仪器：UV-1700紫外分光光度仪(岛津国际贸易有限公司)，迈瑞BC-5300全自动血细胞分析仪(广州润和医疗器械有限公司)，LEICARM 2135 型石蜡切片机(上海仁科生物科技)RM2235切片机(德国LEICA公司)，HC-3618R高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)。

1.2 方法

1.2.1 灌胃药物配制黄芪多糖：准确称取黄芪多糖4 mg，加入0.5 mL无菌0.9%氯化钠注射液中溶解，搅拌均匀，每次实验前现配，用药剂量为8 mg/mL，12.5 mL/kg，每天1次。地塞米松：根据药理学实验动物用药计算方法，地塞米松大鼠用药为人的5倍，用药剂量为地塞米松0.05 mg/mL，每天1次。

1.2.2 分组及给药：健康Wistar大鼠48只，随机分成4组，正常组、模型组、黄芪多糖组、地塞米松组，每组12只。黄芪多糖组、地塞米松组大鼠进行放射性肺损伤造模成功后分别给予相应黄芪多糖、地塞米松灌胃治疗，正常组及模型组给予0.9%氯化钠注射液灌胃治疗，连续8周。每组分别在第2周、第8周各处死6只大鼠，取标本备用。

1.2.3 造模大鼠健康Wistar大鼠，腹腔注射0.3 %戊巴比妥钠1.2 mL/kg麻醉大鼠，按次序仰卧摆放于照射台上，调整照射视野，上至大鼠前肢两腋窝中点连线，下至剑突水平，照射面积为4.5 cm×4 cm。正常组佯装照射，其余各组均用6MV-X线全胸单次照射，300 cGy/min，总剂量为20 Gy，照射前用紫外线照射消毒，上述过程于潍坊市潍坊医学院附属医院放疗科进行。

1.2.4 标本采集及处理:不同处理组的大鼠分别于照射后第2、8周末次给药后禁食12 h，每组随机抽取6只，称重，按照体质量给予0.3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，然后固定在蛙板上，打开胸腔，暴露心脏，立刻心脏采血，置于真空采血管中，备用。取血完毕后，在环状软骨上用血管钳固定器官，其下作倒T形切口，置入连接注射器的静脉输液针，固定，结扎右肺，每次2 mL 0.9%氯化钠注射液灌洗左肺并收集BALF，经4 ℃，1500 r/min离心10 min，弃上清液后储存于-80 ℃冰箱，备用。收集BALF后，迅速摘取左肺组织，经4%甲醛溶液固定，备用。

1.2.5 实验指标利用全自动血细胞分析仪测定血液中的白细胞、红细胞总数。BALF中的白细胞及红细胞计数，在低倍镜下利用细胞计数板计数，肺组织取材修块后，进行脱水、浸腊与包埋等处理。用石蜡切片机进行切片，厚度约4 μm，进行HE染色后，利用光学显微镜进行组织病理学检查，实验重复3次。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 照射后每天对大鼠的精神状态、外貌状况、饮食、饮水及大小便排泄情况进行观察，共8周。正常组大鼠精神状况良好，背部毛发亮泽光滑，饮食及饮水，大小便排泄状况正常；其余3组大鼠照射后陆续出现精神萎靡、活动迟缓、背部毛发脱落稀疏、饮食及饮水较少、大小便排泄减少等症状；照射后2周，黄芪组及地塞米松多糖组大鼠毛发及精神状态较模型组略有改善，但活动迟缓，饮食及饮水量仍较少；随着治疗时间的延长，症状逐渐减轻，照射后8周，黄芪多糖组及地塞米松组大鼠背部毛发脱落情况逐渐改善，恢复亮泽且进食及活动量较前增加。2组出现毛发脱落时间几乎无差异，且脱毛情况略轻于模型组，但2组之间比较差异无统计学意义。

2.2 黄芪多糖对放射性肺损伤大鼠血液中炎性细胞及红细胞的影响 照射后2、8周，与正常组相比，模型组白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞均有明显降低(P<0.05),表明造模成功。照射后2周，黄芪多糖组与地塞米松组血液中的白细胞及红细胞计数明显升高，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。照射后8周，与正常组比较，黄芪多糖组与地塞米松组白细胞及红细胞回升，差异无统计学意义；但与模型组相比，正常组、黄芪多糖组与地塞米松组差异均具有统计学意义(P<0.05)；照射后8周，黄芪多糖组各指标与地塞米松组比较差异无统计学意义。见表2。

表1 照射2周后黄芪多糖对大鼠血液中炎性细胞及红细胞计数的影响Tab.1 Results of inflammatory cells and red blood cellin blood of rats at 2

*P<0.05，与模型组相比，compared with model group；#P<0.05，与正常组相比，compared with normal group

表2 照射8周后黄芪多糖对大鼠血液中白细胞及红细胞计数的影响Tab.2 Results of white blood cell and red blood cellin blood of rats at 8

*P<0.05，与模型组相比，compared with model group；#P<0.05，与正常组相比，compared with normal group

2.3 放射性肺损伤大鼠BALF中细胞计数对照射后2周及8周的大鼠BALF进行采集，并显微镜下细胞计数。见表3。照射后2、8周，与正常组相比，模型组白细胞、红细胞均有明显升高(P<0.05),表明经过放射线照射后，大鼠肺部血管内皮细胞损伤，血管通透性增加，导致炎症细胞渗出，组织充血形成了放射性肺损伤模型。照射后2周，黄芪多糖组与地塞米松组血液中白细胞及红细胞计数均明显低于模型组(P<0.05)，说明在放射性肺损伤早期，黄芪多糖与地塞米松均能缓解放射性肺损伤导致的炎症细胞浸润及充血现象，且黄芪多糖治疗效果与地塞米松无差异。照射8周后，与模型组比较，黄芪多糖组与地塞米松组白细胞及红细胞计数均降低(P<0.05)；与正常组相比，黄芪多糖组白细胞及红细胞计数差异有统计学意义(P<0.05)；但地塞米松组与正常组比较差异无统计学意义；但黄芪多糖组与地塞米松组比较，差异无统计学意义，说明在放射性肺损伤晚期，黄芪多糖能够减轻放射性肺损伤导致的充血、炎症细胞渗出等现象，且治疗作用与地塞米松相近。

表3 黄芪多糖对大鼠肺泡灌洗液中白细胞及红细胞 计数的影响Tab.3 Results of white blood cell and red blood cell in BALF of rats at 2 w and 8

*P<0.05，与模型组相比，compared with model group；#P<0.05，与正常组相比，compared with normal group

2.4 各组大鼠肺组织肉眼观察结果比较 正常组大鼠肺组织表面光滑，呈粉红色，质地柔软弹性良好且可完全伸展。照射后2周，模型组大鼠肺组织颜色呈暗红色，质地较韧，可见斑片状出血，轻度肿胀；黄芪多糖组和地塞米松组肺组织呈鲜红色，质地较韧，轻度肿胀，可见少量点状出血点。照射后8周，模型组大鼠肺组织呈暗红色，照射区域表面凹凸不平并呈现灰白色，质地变硬，弹性降低，肺组织明显肿胀且可见明显灶状出血点；黄芪多糖组及地塞米松组肺组织呈深红色，质地较韧，轻度肿胀，肺组织出现白色脓点及出血点，与模型组比较程度较轻。

2.5 各组大鼠肺组织病理学结果比较 正常对照组肺组织结构清晰，支气管、肺泡及肺泡壁结构正常，肺间质无增生，无炎性细胞浸润。大鼠2周肺组织HE染色结果见图1，模型组大鼠肺泡壁破裂、肺泡间隔增宽、肺间质增生、肺泡腔及肺间质有大量炎性细胞渗出；黄芪多糖组肺组织结构大致清晰，肺泡间隔增宽，且有炎性渗出物，但较模型组减轻；地塞米松组大鼠肺组织结构清楚，部分肺泡间隔可见炎性渗出，较模型组明显减少。大鼠8周肺组织HE染色结果见图2，模型组大鼠肺泡壁结构破坏、血管及肺间质内有充血现象、肺泡间隔增宽断裂、淋巴细胞浸润、纤维增生明显，与正常组比较差异明显；黄芪多糖组大鼠肺组织结构大致清晰，仅有少量炎症细胞浸润，较模型组明显减轻；地塞米松组大鼠肺组织结构大致清晰，少量炎性细胞浸润，与模型组比较明显减轻。

图1 照射2周后各组大鼠肺组织病理形态学观察(HE，×40)Fig.1 Pathological pictures of lung tissue in different groups after 2 w post-injury(HE，×40)

图2 照射8周后各组肺组织病理形态学观察(HE，×40)Fig.2 Pathological pictures of lung tissue in different groups after 2 w post-injury(HE，×40)

3 讨论

放射治疗是恶性肿瘤治疗的一种重要手段，而肺组织对放射较敏感，对于胸部恶性肿瘤施行放射治疗容易导致放射性肺损伤。大鼠是常见的构建放射性肺损伤的模型生物。杜雪梅等[6]用20 Gy或30 Gy单次剂量射线照射成功建立了放射性肺损伤动物模型。陆忠华等[7]采用12 Gy或20 Gy单次照射成功建立了放射性肺损伤模型。本实验采用6 MV-X线全胸单次照射，300 cGy/min，总剂量为20 Gy，建立了大鼠放射性肺损伤模型。

黄芪是一种含有多种成分的中药，报道称黄芪能够减轻肺损伤并能够保护肺泡上皮细胞，调节机体免疫力，促进氧自由基的排出，而起到抗纤维化的作用[8-9]。黄芪多糖是从黄芪中提取的主要活性成分，其承载了黄芪的多种优良作用，但其是否能够改善放射性肺损伤，目前对此相关研究甚少。本实验结果显示大鼠经过照射后出现活动迟缓，精神萎靡以及颈背部脱毛、毛发枯燥等现象，经过黄芪多糖以及地塞米松处理后的大鼠上述情况逐渐改善。

放射性治疗不仅对肿瘤细胞具有强大的杀伤力，同时对正常组织细胞也具有较强的杀伤力，会明显降低血液中白细胞及红细胞水平，同时患者的免疫力也随之下降[10-13]。目前临床上治疗放射性肺损伤最常用的药物为糖皮质激素[14]。本实验模型组大鼠血液中白细胞及红细胞计数明显降低，而黄芪多糖组及地塞米松组随着给药时间的延长，白细胞及红细胞呈回升趋势，且2者无明显差异，说明黄芪多糖能够改善放射性肺损伤，作用效果与地塞米松相似。

研究表明经过放射性射线照射后，肺部毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞损伤，会进一步导致血液中白细胞及红细胞计数降低，及支气管内腔内炎症细胞渗出并充血[15-16]。本实验模型组大鼠BALF中白细胞及红细胞计数明显升高，说明模型组大鼠经过照射后肺部支气管炎症细胞渗出并出现充血现象；而经过黄芪多糖及地塞米松治疗后，BALF中白细胞及红细胞计数明显降低，说明黄芪多糖可减轻放射性肺损伤引起的肺部炎症及充血现象。与地塞米松相比，黄芪多糖组BALF中细胞计数差异无统计学意义，说明2者作用相似，均可以改善放射性肺损伤导致的肺部炎症细胞渗出及充血现象。

刘纯杰等[17]和曹小飞等[18]研究证明放射性肺损伤的病理形态学改变主要为肺泡及间质充血，炎性细胞浸润渗出，肺泡间隔增宽，后期可出现纤维组织增生等。在照射后2周，模型组大量炎症细胞浸润，肺泡壁破裂，少量纤维结缔组织增生，而黄芪多糖组与地塞米松组大鼠肺组织病理学显示炎症明显减轻，减轻程度几乎相同。在照射后8周，模型组大鼠可见肺泡间隔增宽断裂，炎症细胞浸润明显，纤维增生明显，而黄芪多糖组及地塞米松组大鼠较模型组明显减轻，减轻程度大致相同。

综上所述，本实验成功构建了放射性肺损伤大鼠模型，并对其进行药物干预，分析了其外周血液及BALF中炎性细胞、红细胞含量和肺组织病理学变化，阐明了黄芪多糖能够明显改善放射性肺损伤大鼠的生活质量及肺部炎症，其作用于地塞米松大致相同，为黄芪多糖进一步应用于临床治疗放射性肺损伤提供了重要的理论依据。

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(编校：吴茜)

Experimental study of astragaluspolysaccharides on the prevention of radio-pulmonary lesion in Rats

ZHANG Hai-jing1†, HU Zhao-qiu2†, SUN Yu-qing1, FENG Zhan-qin3, SHANG Hong-cai4, ZHANG Wei-fen3,4Δ

(1.College of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 2.Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Second People’s Hospital of Weifang, Weifang 261041, China; 3.Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Weifang Medical University, Weifang 261053, China；4.Department of Traditional Chinese Internal Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

ObjectiveTo investigate the effects of astragalus polysaccharides on radio-pulmonary lesion. Methods 48 Wistar rats were divided into normal group, model group, astragalus polysaccharides treated group and dexamethasone treated group, each had 12 rats. Models of radio-pulmonary lesion of rats in later three groups were established by whole-thorax irradiation 20 Gy, then normal group was pretending to irradiation. Rats in normal group and model group were given 0.9% NaCl, astragalus polysaccharides treated group and dexamethasone treated group were given astragalus polysaccharides(8mg/mL) and dexamethasone(0.05mg/mL), accordingly. All rats were with 8 weeks, at 2 w and 8 w post-injury, 6 rats in each group were selected randomly and anesthesia to death. The erythrocytes and leukocytes in blood and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) in each group were detected and histological examination of lung tissues were performed by Haematoxylin and Eosin staining to study general morphology. ResultsRadiation-induced lung injury rat model were successfully constructed, general observation showed that irradiated rats gradually appear listlessness, reduce the volume of activities, arched, hair removal and other symptoms, astragalus polysaccharide (APS) and dexamethasone treated rats had gradual improvement than model group. Compared with control group, erythrocytes and leukocytes counts in serum of model group at 2 w and 8 w post-injury were significantly decreased(P<0.05), the numbers of erythrocytes and leukocytes in BALF were significantly increased(P<0.05).Compared with model group group, the leukocytes, erythrocytes and neutrophils counts in serum of astragalus polysaccharides treated group and dexamethasone treated group were all increased(P<0.05), respectively, and the number of leukocytes and erythrocytes in BLAF were significantly decreased(P<0.05). All the indexes between two groups had no significant difference. The pathological changes of lung tissues showed that rats in model group had rupture alveolar wall, widened alveolar interval, pulmonary interstitial hyperplasia, and the alveolar space and interstitial lung stroma had a large number of inflammatory cells exudation. The symptoms in astragalus polysaccharides treated group and dexamethasone treated group were all alleviated, and there was no significant difference between the two groups. ConclusionAstragalus polysaccharides have therapeutic effect on radio-pulmonary lesion in rats, and the therapeutic effects of astragalus polysaccharides are roughly similar to dexamethasone. Further research is needed to elucidate the mechanism behind the effects of astragalus polysaccharides in order to develop appropriate treatment.

radio-pulmonary lesion; astragaluspolysaccharides; inflammation cells; bronchoalveolar lavage fluid

国家科技部星火科技计划项目(2013GA740103)；国家自然科学基金(81573717)；山东省自然科学基金(ZR2012CM025)；山东省科技攻关(2012YD18063)

张海静，女，硕士在读，研究方向：呼吸系病学,E-mail:：zhanghaijingwin@163.com；胡兆秋，共同第一作者，男，副主任医师，研究方向：呼吸与危重症医学，E-mail:zhaoqiuhu@126.com;张维芬，通讯作者，女，博士，硕士生导师、教授，研究方向：药物新剂型与生物材料，E-mail:：zwf2024@126.com

R563.8

A

1005-1678(2015)09-0008-04