不同β-环糊精衍生物的恩替卡韦包合物的溶解度和溶出度研究

王鹛嵩,吴海涛,王敏,陈声文

(1.海南省人民医院 药学部，海南 海口 570311；2.海南百信药业有限公司制药厂，海南 海口 570216)



不同β-环糊精衍生物的恩替卡韦包合物的溶解度和溶出度研究

王鹛嵩1,吴海涛1,王敏1,陈声文2

(1.海南省人民医院 药学部，海南 海口 570311；2.海南百信药业有限公司制药厂，海南 海口 570216)

目的 研究和制备了不同β-环糊精衍生物的恩替卡韦包合物，探讨不同包合物对恩替卡韦溶解度和溶出度的影响。方法 建立标准回归方程，采用磁力搅拌法、研磨法和超声法制备包合物，以包合率为目标，通过考察摩尔比、包合温度、包合时间、搅拌速率等因素对包合的影响，从而得到最佳包合工艺条件；采用高效液相色谱法测定不同包合物的溶解度并用小杯法考察了体外溶出度。结果 回归方程为A=1.026×106C+4248.8，R2=0.9999(n=6)，在0.497～4.97 μg/mL范围内的线性关系良好；得到的最佳包合方法为磁力搅拌法，最佳包合工艺条件为A摩尔比为1︰1，搅拌速率300 r/min，包合时间为4h，包合温度50 ℃；恩替卡韦在不同的β-环糊精衍生物包合后得到白色疏松状粉末物质。ETV、β-CD-ETV、HP-β-CD-ETV、 RM-β-CD-ETV、2，6-DM-β-CD-ETV的溶解度分别为2.51、13.4、18.9、37.6、89.5 g/L，采用不同的环糊精衍生物都具有显著的增溶作用。恩替卡韦的不同环糊精衍生物的包合物的溶出度为ETV<β-CD-ETV

恩替卡韦；β-环糊精及其衍生物；包合物；溶解度；溶出度

临床研究证实，恩替卡韦(entecavir, ETV)是一种强效选择性鸟嘌呤核苷类似物，具有显著的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的活性[1-3]。ETV较拉米夫定(lamivudine，LAM)具有更加显著的病毒抑制作用，几乎没有副作用，且耐药性很低，在治疗慢性乙型肝炎药物中被认为有很好的临床应用前景[4-6]。由于恩替卡韦是难溶性药物，一般的片剂对于药物的溶出有一定的影响。利用β-环糊精(β-cyclodextrin，β-CD)和β-CD衍生物与药物包合的研究相当广泛[7-10]。β-CD及其衍生物是内亲水外疏水的“锥筒”结构，能有效包合一些难溶性的药物并增加其溶解性和溶出度。β-环糊精不仅能与其空穴大小相容性的化合物形成包合物，也能通过难溶性药物上某些特定基团或侧链插入环糊精的空穴形成包合物来增加其溶解性和溶出度。β-CD对一些不溶性药物有很好的包合作用，但分子中C2和C3羟基之间形成分子内氢键而导致其自身水溶性变差，采用羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)、甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin，RM-β-CD)、2，6-二甲基-β-环糊精(2，6- dimethyl-β-cyclodextrin，2，6-DM-β-CD)破坏了分子内氢键，大大地提高了其水溶性和亲水性。本实验采用上述4种材料包合恩替卡韦，研究其对恩替卡韦溶解性和溶出度的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 1260型高效液相色谱仪、1260色谱工作站和DAD检测器(安捷伦公司)；BS110S/BT125D电子分析天平、PH-10型PH计(赛多利斯公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市科瑞仪器有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(北京陆希科技有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；ZRS-8G智能溶出试验仪(天津市天大科技有限公司)。

1.2 药品与试剂 恩替卡韦原料药(海南中和药业有限公司，批号： 201403)；恩替卡韦对照品(中国药品生物制品检定所，批号：201109-201408)；β-环糊精(上海伯奥生物科技有限公司)；羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、2,6-二甲基-β-环糊精(上海伯奥生物科技有限公司)；甲醇、乙腈(AR)；去离子水；0.1M盐酸溶液(自配)。

1.3 方法

1.3.1 恩替卡韦标准曲线的建立：HPLC法测定的色谱条件： YMC-Pack Pro C18柱(250×4.6 mm，5 mm)，以乙腈-水(3︰97)为流动相A，乙腈为流动相B，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃。

精密称取25 mg(以无水物计)恩替卡韦对照品，置于100 mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀。再精密量取10 mL，置于50 mL容量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀。精密量取此溶液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0和5.0 mL分别置于50 mL容量瓶中，加流动相A稀释至刻度。制成系列浓度的线性溶液。分别量取各线性溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算峰面积。

1.3.2 包合方法的选择：目前制备环糊精包合物常用且操作方便的方法有磁力搅拌法、研磨法和超声法[11]，本实验以羟丙基-β-环糊精为代表，按物质的量比2︰1精密称取羟丙基-β-环糊精和恩替卡韦3份，分别用磁力搅拌法、研磨法和超声法制备包合物和用无水乙醇和水来洗涤3次包合物，使游离恩替卡韦和未包合的环糊精洗净。

1.3.3 包合物的制备：称取羟丙基-β-环糊精(以2-羟丙基为代表)适量，置于50 mL圆底烧瓶，加入一定量的蒸馏水形成饱和溶液。在恒温加热磁力搅拌器升温至50 ℃，缓慢滴入100 mg已溶于适量甲醇的恩替卡韦，恒温搅拌4 h，冷却后放入冰箱冷藏24 h，抽滤，用少量的甲醇洗涤滤饼3次，除去游离的恩替卡韦，放入50 ℃真空干燥箱干燥6 h，其他的3种β-环糊精也做同样处理。

1.3.4 包合物的熔点测定：对4种环糊精衍生物和4种衍生物的包合物进行熔点测定，包合物熔点与4种环糊精衍生物和恩替卡韦熔点明显不同，证明了包合物为新的物相。

1.3.5 包合物制备最佳工艺优化：本实验以羟丙基-β-环糊精为例，以摩尔比、包合温度、包合时间和搅拌速率为因素，分别进行了单因素试验，结合单因素的分析进行了以摩尔比、包合温度、搅拌速率包合时间和为因素设计了3水平4因素L9(34)正交试验，见表1。

表1 正交设计因素表Tab.1 Orthogonal design factors and levels

1.3.6 溶解度的测定：分别精密称取50 mg最佳工艺条件制备的4种恩替卡韦包合物和恩替卡韦，置于6支10 mL的具塞试管，加入10 mL去离子水，超声10 min后，使之形成过饱和溶液，放入37 ℃温水浴中孵育24h后用0.45 μm的微孔过滤，分别取1 mL的滤液用流动相A稀释至100 mL，分别量取各溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积。然后对照恩替卡韦标准曲线，计算出各包合物和恩替卡韦的溶解度及增溶的效果，结果为3次测定的平均值。

1.3.7 溶出度的考察：取恩替卡韦及其不同的β-环糊精衍生物包合物以0.1 mol/L盐酸溶液为溶出介质，照溶出度测定法，温度在37 ℃±0.1 ℃，转速50 r/min，分别于5、10、15、20、30和45 min吸取溶液适量(同时补加等量同温溶出介质)，用0.45 μm滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液，量取上诉供试品溶液及对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算溶出量，绘制溶出曲线。

2 结果

2.1 恩替卡韦标准曲线的建立 以恩替卡韦浓度为横坐标，主峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为A=1.026×106C+4248.8，R2=0.9999(n=6)。说明恩替卡韦在0.497～4.97 μg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。见图1。

图1 恩替卡韦的标准曲线图Fig.1 Standard curve of entecavir

2.2 包合方法的选择 测定3种方法制备的包合物的包合率，结果表明：磁力搅拌法的包合率最高，故选择此方法来制备恩替卡韦包合物。见图2。

图2 3种包合方法比较Fig.2 Comparison of three inclusion methods

2.3 包合物的制备 得到白色疏松状粉末物质非晶型粉末状，安全性好，局部刺激性。

2.4 4种环糊精衍生物及其包合物的熔点测定 恩替卡韦及其包合物的熔点见表1。

表1 恩替卡韦及其包合物的熔点Tab.1 Melting points determination of entecavir and its inclusion compound

2.5 包合物制备最佳工艺优化 由极差(R)分析可以看出，各因素对包合效果的大小顺序为A>C>B>D，即投料比>包合时间>包合温度>搅拌速率。其中投料比是影响包合的主要因素，包合时间其次，搅拌速率的影响最小。根据包合率分析可知，最佳包合工艺条件为A1B2C2D2，即摩尔比为1︰1，搅拌速率300 r/min，包合时间为4 h，包合温度50 ℃，羟丙基-β-环糊精包合恩替卡韦的最高包合率为48.93%，见表2。对于实验中用到其他的3种环糊精衍生物对恩替卡韦包合物都做了同样的单因素的考察，也都设计了4因素3水平的正交试验，从而得到各物质的包合最佳工艺，见图3。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test

图3 4种包合物质的包合率比较Fig.3 Comparison of inclusion rates of four inclusion complexes of β-CD with entecavir

由图3可知，以包合率为目标，其对恩替卡韦的包合工艺为：2，6-DM-β-CD>RM-β-CD>HP-β-CD>β-CD。环糊精衍生物的亲脂性与其包合能力相关的，恩替卡韦是一种疏水性的物质，而这4种物质的亲脂性为2，6-DM-β-CD>RM-β-CD> HP-β-CD>β-CD，因此2，6-DM-β-CD对恩替卡韦的包合效果是最好的。

3.6 溶解度的测定 恩替卡韦-2，6-二甲基-β-环糊精溶解度最大，较之恩替卡韦在水中的溶解度增加了35.6倍，见图4。

图4 恩替卡韦及其包合物在水中的溶解度Fig.4 Solubility of entecavir and its inclusion compound in water

3.7 溶出度的考察 恩替卡韦原药的溶出速度较低，经β-环糊精包合后，溶出速度有显著的提高，表明原药形成包合物后，可能形成分子胶囊，增加了疏水性药物的溶解度，从而加快其溶出，见图5。

图5 恩替卡韦及其包合物的溶出曲线Fig.5 Dissolution curve of entecavir and its inclusion compound

3 讨论

β-环糊精是近年来备受关注的新型药物包合材料，这主要是由于β-环糊精具有特殊的分子结构，即呈闭合筒状结构，外部是亲水性的表面，内部则是一个具有一定尺寸的手性疏水管腔，能包合一定大小的药物分子，形成一种特殊的包合物，从而改变药物的特性[12-13]。近年来，有关β-环糊精及其衍生物的研究已取得了显著的发展[14]。β-环糊精分子中C2和C3羟基之间形成分子内氢键而导致其水溶性差，在水中β-环糊精的溶解度仅为1.85 g，使之在许多应用上受到限制[15]。而β-环糊精甲基化后形成的二甲基β-环糊精具有高水溶性，在水中溶解度达55 g，比天然β-环糊精在水中溶解度提高了近30倍。当然也增加了包合药物在水中的溶解度。羟丙基-β-环糊精的特性为水溶性大(>50%)，产品呈非晶型粉末状，安全性好，局部刺激性小。羟丙基功能团具亲水性，所以羟丙基环糊精具有水溶性和亲水性的性质，亲水性是其最大的优点，易与生物环境相容，还因表面活性较小，不易引起在动物体内的溶血,生物安全性更好。羟丙基-β-环糊精分子呈中空截头圆锥状，中间为疏水性空腔，与药物客分子形成包合物之后可完全或部分遮掩疏水性药物分子中的某些基团，从而不但可以提高药物本身的稳定性，同时又可减低或消除药物对机体的某些毒副作用。β-环糊精衍生物具有比母体环糊精更优良的特性，能解决许多技术难题，是改进药剂处方的有效辅料。

本实验采用磁力搅拌法制备4种β-环糊精-ETV包合物，通过3水平4因素L9(34)正交试验，得到最佳包合工艺条件。包合物的这种特殊分子结构能显著增加恩替卡韦的溶解度和提高溶出度，这为进一步开发恩替卡韦新剂型提供了理论依据。

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(编校：王冬梅)

Study on different β- cyclodextrin and its derivatives for solubilization and dissolution of entecavir

WANG Mei-song1,WU Hai-tao1,WANG Min1,CHEN Sheng-wen2

(1.Department of Pharmacy, Hainan People’s Hospital, Haikou 570311, China; 2.Hainan Pashun Pharmaceutical Co., Ltd., Pharmaceutical Factory, Haikou 570311, China)

ObjectiveTo prepared inclusion complex of β-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives (methyl -β-cyclode- xtrin, 2,6-dimethyl -β- cyclodextrin, hydroxypropyl -β-cyclodextrin) with entrcavir,and explore effect of different inclusion complex on the solubility and dissolution of entecavir.MethodsRegression equation was established,prepared the inclusion complexes by a magnetic stiring method,grinding method and ultrasonic method.While inclusion rate was an index,the effects of reaction process was inquired by mole ratio, inclusion temperature, inclusion time and stirring rate and the most suitable method and technology of inclusion was optimized.Determinated the solubility with HPLC method and investigated in vitro dissolution with a small cup method.ResultsThe regression equation was A=1.026×106C+4248.8, R2=0.9999 (n=6), in the range of 0.497～4.97 g/mL, linear relationship was good.The best inclusion method was magnetic stirring, the best process conditions were: mole ratio was 1︰1, stirring speed was 300 r/min, inclusion time was 4 hours, inclusion temperature was 50 ℃.The four inclusion complexes all were white loose powder materials.The solubility of ETV，β-CD-ETV，HP-β-CD-ETV，RM-β-CD-ETV，2,6-DM-β-CD-ETV were 2.51, 13.4, 18.9, 37.6 and 89.5 g/L.The dissolution rates was ETV<β-CD-ETV

entecavir;β-cyclodextrin and its derivatives; inclusion complex; solubility;dissolution

王鹛嵩，女，本科，副主任药师，研究方向：医院药学，E-mail：mrswangdoctor@163.com。

R944.4; R943.3

B

1005-1678(2015)03-0172-04