丹皮酚对HepG2细胞药物转运体BCRP及SLCO1B1表达及功能的影响

王莉莉，于超

(重庆医科大学 生命科学研究院，重庆 400016)



丹皮酚对HepG2细胞药物转运体BCRP及SLCO1B1表达及功能的影响

王莉莉，于超Δ

(重庆医科大学 生命科学研究院，重庆 400016)

目的 分析丹皮酚对肝细胞株HepG2细胞药物转运体乳腺癌耐药蛋白(breast cancer-resistance protein，BCRP)及有机阴离子转运多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1Bl，SLCO1B1)表达及部分转运功能的影响。方法 采用CCK8法检测丹皮酚对HepG2细胞存活率的影响，以确定适当的用药浓度；qPCR法测定丹皮酚对HepG2细胞BCRP及SLCO1B1 mRNA表达水平的影响；流式细胞术测定丹皮酚对BCRP及SLCO1B1转运特异性底物脱镁叶绿酸盐和二氯荧光素功能的影响。结果 丹皮酚在2～8 μg/mL浓度范围内对HepG2细胞存活率影响较小，丹皮酚浓度高于16 μg/mL时，HepG2细胞存活率明显降低(P<0.05)。与对照组相比，丹皮酚组BCRP及SLCO1B1药物转运体的mRNA水平均明显上调，对特异性底物的转运效率明显增加(P<0.05)。结论 丹皮酚能够诱导肝细胞药物转运体BCRP及SLCO1B1基因表达，从而促进其底物的跨膜转运。提示当丹皮酚与BCRP及SLCO1B1转运体所转运的药物联合应用时，可能存在药物相互作用风险。

丹皮酚；HepG2细胞；乳腺癌耐药蛋白；有机阴离子转运多肽1B1

药物代谢酶及药物转运体在体内药物代谢中起着非常重要的作用，长期以来研究者主要关注药物代谢酶介导的药物相互作用，对药物转运体介导的药物相互作用近年来才受到越来越多的重视[1-4]。研究表明：许多药物(如抗动脉粥样硬化HMG-CoA抑制剂——他汀类药物)在体内主要依赖药物转运体的跨膜转运发挥治疗作用[5-6]。其中，有机阴离子转运多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1Bl，SLCO1B1)是摄入型转运体，特异性表达于肝脏，摄取转运大量分子结构各异的化合物，促进药物聚集于胞内[2]。相反，乳腺癌耐药蛋白(breast cancer-resistance protein，BCRP)是一个外排型转运体，广泛分布于小肠、直肠、肝脏、肾脏、干细胞、卵巢、乳腺、脑、心脏以及肿瘤细胞中[7]。所以，BCRP转运体主要负责减少转运药物进入内脏、血脑屏障、胎盘屏障或将内源性底物排入胆汁、尿液，从而发挥降低靶组织药物浓度或体内血药浓度等生理功能[8]。因此，SLCO1B1与BCRP对人体内药物分布与排泄起到了非常重要的作用。

丹皮酚(paeonol)为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffrutlcosaAndr根皮及萝藦科植物徐长卿Cynanchumpaniculatum(Bge.)Kitag的干燥根和根茎中的主要活性成分之一，其药理作用广泛，具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等作用[9-11]。近年来研究发现，丹皮酚可抑制药物转运体P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-GP/MDR1)表达，从而降低P-糖蛋白对药物的外排功能[12-13]。那么丹皮酚是否可以通过影响肝细胞SLCO1B1及BCRP转运体的药物转运功能，进而影响与其联用药物的体内分布与排泄，最终影响相关药物的疗效，促进药物-药物相互作用，目前尚未见报道。因此，本实验主要分析丹皮酚是否影响SLCO1B1与BCRP的基因表达，通过检测2者对特异性底物的转运能力，推测丹皮酚对2种转运体跨膜转运药物功能的影响，预测潜在的药物-药物间相互作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 丹皮酚(纯度：99%)购自南京泽朗植提。二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma。脱镁叶绿酸盐(PhA)与二氯荧光素(DCF)购自百灵威科技。TaKaRa RNAiso Plus及PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自宝生物工程(大连)有限公司；引物用Primer Premier 5.0软件设计，委托华大基因合成；DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；CCK8试剂盒购自碧云天。细胞培养板购自Costar公司。

1.2 细胞培养 细胞株人肝癌细胞HepG2为本实验室保存。HepG2细胞接种于含10%灭活胎牛血清、抗生素(100 mg/mL青霉素和100 U/mL链霉素)的DMEM高糖培养基中。HepG2细胞在37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱内培养。用0.25%胰酶消化、传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 主要溶液配制

1.3.1 丹皮酚溶液的配制：分别称取2、4、8、16 mg丹皮酚溶于1 mL DMSO中，超声震荡，以0.22 μm过滤膜滤过，终质量浓度浓度分别为2、4、8、16 μg/ μL， 4 ℃冰箱保存。

1.3.2 脱镁叶绿酸盐(PhA)溶液的配制：称取0.593 mg PhA，溶于1 mL DMSO溶液中，超声震荡，以0.22 μm过滤膜滤过，终质量浓度为0.593 μg/ μL，4 ℃冰箱保存。

1.3.3 二氯荧光素(DCF)溶液的配制：称取4.012 mg DCF，溶于1 mL DMSO溶液中，超声震荡，以0.22 μm过滤膜滤过，终质量浓度为4.012 μg/ μL，4 ℃冰箱保存。

1.4 实验分组与处理 Control组：含0.1%DMSO培养基组；丹皮酚处理组：分别加入各浓度丹皮酚溶液1 μL，使丹皮酚终浓度分别为2、4、8 μg/mL，同时，DMSO终浓度为0.1%。实验处理：细胞接种约36 h后，丹皮酚组加入不同浓度的丹皮酚，control组加同体积终浓度为0.1%的DMSO处理24 h。

1.5 CCK8法 取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔200 μL。18 h后，按分组培养处理，每个组分别设置5个复孔，同时设置空白对照组。药物分别作用6,12,24,48 h后，每孔加入100 μL比例为1:10的CCK8与DMEM的混合液，继续培养2.5 h后，在酶联免疫检测分析仪上测定A450值。按以下公式计算药物对细胞存活率的影响，实验以3次平行实验数据为最终结果：细胞存活率 = (A处理-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

1.6 Real-time qPCR法检测BCRP及SLCO1B1转运体mRNA的表达 采用Trizol法提取总RNA；用PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒按说明书操作反转录成cDNA。荧光定量PCR检测BCRP(82bp)及SLCO1B1(165bp)转运体基因产物，以GAPDH(226bp)做内参。反应体系：SYBR green mix 10 μL、上下游引物各0.6 μL、cDNA 2 μL、RNase-free水6.8 μL；反应条件：95°C 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40次循环，于65 ℃～95 ℃条件下检测溶解曲线。

BCRP序列上游引物： 5′-AGCAGGGACGAACAATCATC-3′，下游引物： 5′-GGGCCAATAAGGTGAGGCTATCA-3′；SLCO1B1序列上游引物：5′-TGAATGCCCAAGAGATGA-TG-3′，下游引物： 5′-ATTGAGTGGAAACCCAGTGC-3′; GAPDH引物序列上游: 5′-GTGAAGGTCGGAGTCA-ACGG3′，下游引物： 5′- CCTGGAAGA-TGGTGATGGGAT-3′。

1.7 流式细胞术检测BCRP及SLCO1B1转运体功能 取对数生长期细胞，调整细胞密度为4×105个/mL，接种于6孔板中，每孔接种细胞悬液1 mL。36 h后，向control组、丹皮酚2、4、8 μg/mL组中分别加入1 μL DMSO、1 μL 2、4、8 μg/μL丹皮酚溶液，处理24 h后加入转运体特异性荧光底物1 μL DCF[14](4.012 μg/ μL)或1 μL PhA[15](0.593 μg/ μL)，于37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱内培养30 min，按照细胞培养传代方式处理，预冷PBS悬浮后进行流式细胞仪分析。同时设置空白组。

2 结果

2.1 不同浓度丹皮酚对HepG2细胞存活率的影响 采用CCK8法对丹皮酚的细胞增殖效应进行分析，结果显示：与control组相比，2、4、8 μg/mL丹皮酚并不降低细胞增殖效应，但16 μg/mL丹皮酚显著降低细胞增殖效应，其存活率分别为97.85%、94.99%、91.23%、84.70%，见图1。提示丹皮酚(2～8 μg/mL)对 HepG2细胞增殖效应无影响，故后续实验采用该浓度范围。

图1 丹皮酚对HepG2细胞存活率的影响(n=5)*P<0.05，与对照组相比Fig.1 Effect of various concentrations of paeonol on viability of HepG2 cell(n=5)*P<0.05, compared with control group

2.2 丹皮酚不同处理时间对HepG2细胞存活率的影响 采用CCK8法对丹皮酚的细胞增殖效应进行分析，结果表明：8 μg/mL 丹皮酚处理HepG2细胞6、12、24、48 h，存活率分别为98.51%、96.31%、91.46%、89.36%。虽然随着丹皮酚作用时间的延长，HepG2细胞存活率相应降低，但细胞存活率大部分超过90%(见图2)。提示2～8 μg/mL丹皮酚处理HepG2细胞24 h对其活力影响不大。故以下实验对细胞进行药物处理时间均采用24 h。

图2 丹皮酚不同处理时间对HepG2细胞存活率的影响(n=5)*P<0.05，与对照组相比Fig.2 Effect of various treatment time of paeonol on viability of HepG2 cells(n=5)*P<0.05, compared with control group

2.3 丹皮酚对HepG2细胞中BCRP、SLCO1B1 mRNA表达的影响 将培养的HepG2细胞以不同浓度的丹皮酚(2～8 μg/mL)分别作用24 h。结果显示：丹皮酚可显著上调细胞中BCRP与SLCO1B1 mRNA的表达(P<0.05)。2 μg/mL丹皮酚可分别上调BCRP与SLCO1B1 mRNA表达2倍与3.5倍，4、8 μg/mL丹皮酚虽对BCRP与 SLCO1B1 mRNA仍有诱导作用，但诱导作用较2 μg/mL丹皮酚降低，见图3。提示丹皮酚可能通过诱导HepG2细胞的药物转运体BCRP、SLCO1B1mRNA表达影响其对底物的转运效率。

图3 丹皮酚孵育HepG2细胞后BCRP及SLCO1B1转运体mRNA的变化(n=5)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组相比Fig.3 Expression levels of transporters BCRP and SLCO1B1 mRNA after incubation of paeonol(n=5)*P<0.05,**P<0.01， ***P<0.001, compared with control group

2.4 丹皮酚对HepG2细胞BCRP、SLCO1B1转运功能的影响 用流式细胞技术检测不同浓度丹皮酚作用细胞24 h后，对特异性荧光底物的转运效率。结果显示：与对照组比较，不同浓度丹皮酚(2～8 μg/mL)处理组的荧光强度值均显著降低(P<0.05)。其中2 μg/mL浓度处理组荧光强度值降低幅度最大，达2倍，见图4。提示丹皮酚可增强HepG2细胞BCRP对药物的外排功能。

图4 丹皮酚对HepG2细胞BCRP转运特异性底物PhA的影响(n=5)*P<0.05，***P<0.001，与对照组相比Fig.4 Effect on BCRP-mediated PhA transfer after the incubation of paeonol(n=5)*P<0.05, ***P<0.001, compared with control group

同样亦观察到2～8 μg/mL丹皮酚较对照组能明显增高荧光强度值(P<0.05)，其中2 μg/mL时荧光强度值增高幅度最大，达5～6倍，见图5。结果表明丹皮酚能增强HepG2细胞SLCO1B1对药物的转运能力。

图5 丹皮酚对HepG2细胞SLCO1B1转运特异性底物DCF的影响(n=5)*P<0.05, ***P<0.001，与对照组相比Fig.5 Effect on SLCO1B1-mediated DCF transfer after the incubation of paeonol(n=5)*P<0.05,***P<0.001, compared with control group

3 讨论

随着药物代谢动力学的发展，药物转运体逐渐成为近年来研究的热点，其对阐明药物间相互作用和指导临床用药有重要意义。其中，BCRP外排多种内、外源性物质，比如：他汀类(匹伐他汀、瑞舒伐他汀)、拓扑替康、伊马替尼、舒尼替尼、米托蒽醌等[16-17]。而SLCO1B1摄取多种内、外源性物质，如：他汀类药物(匹伐他汀、瑞舒伐他汀、西立伐他汀、辛伐他汀等)、苄青霉素、甲氨蝶呤、颉沙坦、伊立替康等。因此，BCRP与SLCO1B1对其底物在体内的代谢过程有重要影响[2, 18]。本课题即从转运体的角度，研究丹皮酚对转运体的影响。

本研究发现，丹皮酚可显著诱导BCRP与SLCO1B1的 mRNA表达与转运效率，提示其转运功能的增强很可能是其基因表达上调所致。此外，本研究亦发现丹皮酚在低浓度时诱导作用BCRP最强，且丹皮酚对SLCO1B1的诱导作用较更强，前者是后者的2.5倍。因此，当丹皮酚与BCRP或SLCO1B1转运体的共同底物作用时，药物的摄取率均是显著增强的。

研究发现，丹皮酚能够下调P-gP的药物外排泵功能，使化疗药物在细胞内浓度增加[12-13]；黄酮类等结构特异性药物对BCRP与SLCO1B1转运体分别有一定的抑制作用，进而发生药物相互作用[17, 19-25]。本研究通过实验证实丹皮酚能够同时诱导BCRP与SLCO1B1转运体，且对SLCO1B1的诱导作用显著强于BCRP，为丹皮酚和SLCO1B1与BCRP的转运药物联合用药时可能发生药物-药物相互作用提供了体外实验数据。

但丹皮酚在体内是否对BCRP与SLCO1B1仍具有诱导作用目前尚不清楚，且丹皮酚诱导BCRP与SLCO1B1表达的信号机制亦不清楚。故未来本课题的研究将主要考察丹皮酚对药物转运体的体内效应及其调控机制。

[1] Glei M,Kirmse A,Habermann N,et al.Bread enriched with green coffee extract has chemoprotective and antigenotoxic activities in human cells[J].Nutr Cancer,2006,56(2): 182-192.

[2] Kim RB.Transporters and drug disposition[J].Curr Opin Drug Discov Devel,2000,3(1): 94-101.

[3] Konig SK,Herzog M,Theile D,et al.Impact of drug transporters on cellular resistance towards saquinavir and darunavir[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(11): 2319-2328.

[4] Weiss J,Haefeli WE.Interaction potential of the endothelin-A receptor antagonist atrasentan with drug transporters and drug-metabolising enzymes assessed in vitro[J].Cancer Chemother Pharmacol,2011,68(4): 1093-1098.

[5] Neuvonen PJ.Drug interactions with HMG-CoA reductase inhibitors (statins): the importance of CYP enzymes,transporters and pharmacogenetics[J].Curr Opin Investig Drugs,2010,11(3): 323-332.[6] Corsini A,Bellosta S.Drug-drug interaction with statins[J].Expert Rev Clin Pharmacol,2008,1(1): 105-113.

[7] Cusatis G,Sparreboom A.Pharmacogenomic importance of ABCG2[J].Pharmacogenomics,2008,9(8): 1005-1009.

[8] Mizuno T,Terada T,Kamba T,et al.ABCG2 421C>A polymorphism and high exposure of sunitinib in a patient with renal cell carcinoma[J].Ann Oncol,2010,21(6): 1382-1383.

[9] Li H, Dai M, Jia W.Paeonol attenuates high-fat-diet-induced atherosclerosis in rabbits by anti-inflammatory activity[J].Planta Med,2009,75(1): 7-11.

[10] 戴敏，訾晓梅，彭代银，等，丹皮酚抗鹌鹑实验性动脉粥样硬化作用[J].中国中药杂志，1999，24(8)：40-42，64.

[11] 杨正生，彭振辉，姚青海，等.丹皮酚的药理作用研究进展[J].中国药物与临床，2011，11(5)：545.

[12] 董会月.丹皮酚逆转人白血病耐药细胞系K562/ADM细胞多药耐药的作用研究[D].2010，福建：福建中医药大学.

[13] 孙慧君，王晓琦，于丽敏，等.丹皮酚对MDR逆转作用的研究[J].解剖科学进展，2000，6(1)：59-62.

[14] 和泉沙希，小森高文，野崎芳胤.用于筛选能够增强或抑制OATP1B1转运活性的化合物的方法、及用于确定OATP1B1表达水平的方法[P].CN 103597090 A.

[15] Lepist EI,Gillies H,Smith W,et al.Evaluation of the endothelin receptor antagonists ambrisentan,bosentan,macitentan,and sitaxsentan as hepatobiliary transporter inhibitors and substrates in sandwich-cultured human hepatocytes[J].PLoS ONE,2014,9(1): e87548.

[16] Keskitalo JE,Zolk O,Fromm MF,et al.ABCG2 polymorphism markedly affects the pharmacokinetics of atorvastatin and rosuvastatin[J].Clin Pharmacol Ther,2009,86(2): 197-203.

[17] Kondo C,Suzuki H,Itoda M,et al.Functional analysis of SNPs variants of BCRP/ABCG2[J].Pharm Res,2004,21(10): 1895-1903.

[18] Hsiang B,Zhu Y,Wang Z,et al.A novel human hepatic organic anion transporting polypeptide (OATP2).Identification of a liver-specific human organic anion transporting polypeptide and identification of rat and human hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitor transporters[M].J Biol Chem,1999,274(52): 37161-13168.

[19] Cooray HC,Janvilisri T,van Veen HW,et al.Interaction of the breast cancer resistance protein with plant polyphenols[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,317(1): 269-275.

[20] Fan L,Zhang W,Guo D,et al.The effect of herbal medicine baicalin on pharmacokinetics of rosuvastatin,substrate of organic anion-transporting polypeptide 1B1[J].Clin Pharmacol Ther,2008,83(3): 471-476.

[21] Hirano M,Maeda K,Shitara Y,et al.Drug-drug interaction between pitavastatin and various drugs via OATP1B1[J].Drug Metab Dispos,2006,34(7): 1229-1236.

[22] Michaelis M,Rothweiler F,Nerreter T,et al.Karanjin interferes with ABCB1,ABCC1,and ABCG2[J].J Pharm Pharm Sci,2014,17(1): 92-105.

[23] Wang X,Wolkoff AW,Morris ME.Flavonoids as a novel class of human organic anion-transporting polypeptide OATP1B1 (OATP-C) modulators[J].Drug Metab Dispos,2005,33(11): 1666-1672.

[24] Weiss J,Rose J,Storch CH,et al.Modulation of human BCRP (ABCG2) activity by anti-HIV drugs[J].J Antimicrob Chemother,2007,59(2): 238-245.

[25] 应帅，郑婷婷，陈培远，等.BCRP/ABCG2的结构功能及相关抑制剂研究[J].中国医药生物技术，2013，8(3)：201-205.

(编校：吴茜)

Effect of paeonol on expression and function of drug transporters BCRP and SLCO1B1 in HepG2 cell

WANG Li-li, YU ChaoΔ

(Institute of Life Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

ObjectiveTo investigate influences of paeonol on mRNA expression and function of drug transporters BCRP and SLCO1B1 in HepG2 cell.MethodsCell counting Kit-8 assay was used to detect the viability of HepG2 cells;Real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR) was performed to measure the expressions of BCRP and SLCO1B1 mRNAs; flow cytometry was applied to determine the transport functions of BCRP and SLCO1B1.ResultsPaeonol (2-8 μg/mL) did not decrease HepG2 cell survival rate, but 16 μg/mL paeonol significantly reduced cell survival rate(P<0.05).Paeonol(2-8 μg/mL)significantly induced the mRNA expression and function of drug transporters BCRP and SLCO1B1(P<0.05).Compared with control group, transcription level of paeonol group’s BCRP and SLCO1B1 drug transporters obviously up-regulated, the of translocation efficiency of substrate specificity increased significantly (P<0.05).ConclusionPaeonol can induce drug hepatocellular transporters BCRP and SLCO1B1 gene expression, thereby promote the substrate transport the transmembrane.It is indicated that the drug combination of paeonol and BCRP and SLCO1B1 transporters, there may be a risk of drug interactions.

paeonol;HepG2 cell;breast cancer-resistance protein;organic anion-transporting polypeptide 1B1

国家自然科学基金(81370403)

王莉莉，女，硕士在读，研究方向：药物代谢动力学，E-mail:wanglili1020@sina.cn；于超，通讯作者，男，博士，教授，研究方向：药物代谢动力学，E-mail:yuchaom@163.com。

R966

A

1005-1678(2015)03-0006-04