葡萄半不育花粉粒形态和细胞学观察及相关基因表达分析

余晓娟，袁 月，王继源，陶建敏

（南京农业大学 园艺学院，南京210095）

植物雄性不育是一种植物在有性繁殖过程中雄性器官发育由于受到某些内、外因素的影响不能产生正常的花药、花粉或雄配子体的遗传现象。雄性不育在植物界中很常见，迄今为止已在43 科，162属的320种植物中发现617例天然的或种属间杂交来源的雄性不育［1］。过去关于植物雄性不育的研究主要集中在水稻、高粱、小麦等农作物以及一些草本植物方面，对于多年生木本植物雄性不育的研究相对 较 少，主 要 有 杉 木［2－3］、桃［4－7］、枣［8］、芒 果［9］、板栗［10－12］、梨［13－15］等，关 于 葡 萄 雄 性 不 育 的 研 究 主 要有雄性不育种质特性研究［16］、不育种质生理生化分析［17－18］以及雄性不育基因的定位［19］、克隆［20］。

半不育现象在1921年就有发现，Terao［21］在水稻品种“Sekiyama”中发现了1 株半不育突变株，1995 年 在“Nakate－shinsenbon”品 种 和“Nippon bare”品种中也发现了半不育突变体，突变率分别为1．68×10－4、8．52×10－5［22］。但是关于其半不育特性及其发生原因的研究较少，Zhou 等［23］观察了“Nippon bare”水稻的后代半不育突变体w207－2的花粉形态及其不育特性，并从中克隆了Pollen Semi－Sterility1基因。目前，在果树上半不育的相关研究还尚未见报道。

绒毡层位于小孢子母细胞和花药壁体细胞之间，广泛存在于陆生植物中并为孢子体母细胞、小孢子、花粉粒提供必需的营养，因此有着相当大的生理意义［24］。绒毡层的发育是一个复杂而精密的细胞行为，而且是在极短时间内接连完成，其中涉及到了大量基因的特异性表达，目前大多数的花粉败育都与绒毡层的异常活动有关系。Zhu等［25］对拟南芥绒毡层形成、发育和功能必不可少的8个调控基因进行分析，假设了一个绒毡层发育的调控网络，在这个绒毡层发育转录调控网中，DYT1 处于SPL／NZZ 和EMS1／EXS 的下游，在绒毡层细胞命运决定后调控绒毡层的发育，这也符合该基因在绒毡层分化与发育过程中的先后表达顺序，TDF1 位于DYT1的下游，对绒毡层向分泌型态的转化起到重要作用。AtMYB103／MS188 处于TDF1 下游，调控绒毡层后期的发育与花粉壁形成。

本试验的研究对象是从‘魏可’（可育）葡萄自交后代中选育出来的单株，‘魏可’实生种子于2008年播种，2011、2012年开花、结果过程中发现部分单株表现出类似于雄性不育的异常表现。对花器官外部形态观察、活力测定及花粉粒形状进行观察以及细胞层次分析，并对绒毡层发育的关键相关基因进行了表达分析，为进一步探讨其半不育产生的原因及分子机理提供基本依据。

1 材料和方法

1．1 试验材料

葡萄品种‘魏可’（可育）（V．vinifera L．cv．Wink）、‘钟山红’（雄性不育）以及2个‘魏可’自交后代单株‘魏可实生－3’、‘魏可实生－12’。

1．2 方 法

1．2．1 花粉外部形态观察 于盛花期采集上述材料的花蕾，将采集的新鲜花蕾于体式显微镜（MoticK－400L）下拍照，观察花器官外观形态。

1．2．2 花粉生活力测定 花前1周将花序套袋，初花期采集花蕾，取下花药于培养皿中，25 ℃培养24 h，收集花粉放入指形管中，干燥后置于4 ℃冰箱储存备用。取低温条件下保存的花粉采用离体萌发法［26］测 定 其 花 粉 生 活 力，滴1 滴 萌 发 培 养 基（0．01%的硼酸、10%的蔗糖和1%的琼脂）于载玻片上，待其冷却后，将花粉均匀散播于培养基表面，25～30 ℃培养24h萌发。在光学显微镜（Olympus BX－532083）下观测萌发情况，统计5个视野下总共300粒花粉的萌发率，花粉管长度大于花粉粒直径的视为萌发。

1．2．3 花粉粒形态的观察 取初花期的花粉粘于双面胶上，经过处理后喷金镀膜（日立E－1010离子溅射仪），在扫描电子显微镜（日立S－3000N 型）下观察拍照。参照牛立新等［27］应用标准差法统计花粉粒的大小及形态。

1．2．4 花药及小孢子细胞学观察 从幼蕾期到初花期，分别采集上述材料的花蕾，每4d采样1次，用于小孢子细胞学观察。不同品种不同发育时期的花粉用FAA 分别固定，4 ℃保存。采用石蜡切片技术，厚度6～8μm，铁矾－苏木精染色，固绿复染，中性树胶封固［28－29］，光学显微镜观察并拍照。

表1 荧光定量PCR 引物序列Table 1 The primers for qRT－PCR

1．2．5 基因表达分析 采用改良CTAB法 提取葡萄各个发育时期的花蕾的RNA，第一链cDNA的合成参照Prime ScriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）操 作 说 明 书。cDNA 稀 释10倍后，取1μL 用于表达分析。荧光定量RT－PCR分析以Actin 为内参基因，在NCBI上根据拟南芥DYT1、TDF1、MYB103基因，查找葡萄中相似性最高的序列，表达分析所用引物见表1，反应体系为稀释10×的cDNA 1μL，上下游引物分别为0．2μL，SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10μL，ddH2O 8．6 μL。反应程序为95 ℃预变性4min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火20s，72 ℃延伸40s，40个循环。数据分析采用7300system 软件和2－△△Ct的方法。

2 结果与分析

2．1 花粉外部及花药形态观察

与‘魏可’相比，‘魏可实生－3’、‘魏可实生－12’开花后雄蕊花丝表现出不同程度的卷曲。‘钟山红’是雌能花品种，其花丝短、花药翻卷［31］。‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’花丝卷曲但并未翻卷，花丝短于花柱。‘魏可’的花药中含有较多的花粉，‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’的花粉含量较少（图1，A～H）。

2．2 花粉生活力鉴定

‘魏可’花粉的萌发率约为70%，‘魏可实生－3’、‘魏可实生－12’的花粉萌发率都为10%左右，萌发率明显低于‘魏可’，只具有一定的萌发能力，‘钟山红’的花粉无萌发力（图2，A～D）。

2．3 花粉粒形态观察

‘魏可’花粉粒为长球形，外壁为孔穴状纹饰，中间分布稀少，两端较为密集（图2，E）；‘钟山红’花粉粒为近球形，花粉外壁为网状及其他不规则状纹饰（图2，6），‘魏可’实生单株包含有长球形花粉粒、近球形花粉粒以及极度变形的花粉粒，长球形花粉粒与‘魏可’外形极为相似（图2，G、H 所示正常的花粉粒）；‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’部分变形花粉粒与‘钟山红’相似（图2，G、H 所示异常的花粉粒）。

2．4 花药和小孢子主要发育时期的细胞学观察

葡萄含有4～5枚雄蕊，每个花药由4个花粉囊和药隔构成，从‘魏可’花药的横切面上可看到正常花药由花粉囊壁和小孢子母细胞组成，花粉囊壁由表皮层、药室内壁、中层和绒毡层组成，围绕着中央的花粉母细胞（图版Ⅰ，1）；小孢子母细胞经过减数分裂后，包围四分体的胼胝质降解，单核小孢子游离出来，刚游离出来的小孢子排列稀松且不规则，小孢子细胞质较浓，细胞核位于中央，绒毡层开始降解，细胞变薄变扁平，药室内壁增厚（图版Ⅰ，2）；小孢子逐渐发育，体积变大，大部分细胞核从中央移至细胞一侧，称为单核早期或单核靠边期，此时，表皮细胞逐渐变得扁平，药室内壁细胞切向伸长，呈纤维状排列，绒毡层细胞逐渐降解（图版Ⅰ，3）；之后小孢子的细胞核进行有丝分裂，生成2个核，呈心形凹陷，形成2个细胞，即生殖细胞和营养细胞，此时期，双核花粉粒积累营养物质，染色较深，绒毡层显著解体，核消失，内含物消失（图版Ⅰ，4）；花粉成熟时期，‘魏可’花粉粒形态均匀一致，染色深，之后两相邻的药室相连，药室开裂，散出花粉（图版Ⅰ，5）。

图2 花粉萌发及花粉粒扫描电镜和透射电镜分析A～D分别为魏可、魏可实生－3、魏可实生－12和钟山红花粉萌发状况；E～H 分别为魏可、钟山红、魏可实生－3和魏可实生－12成熟花粉的扫描电镜图；红色箭头为正常花粉；白色箭头为异常花粉Fig．2 The appearance ofgermination of pollen tube and scanning electron microscope（SEM）images of the mature pollens from grape A－D represent Wink，Wink seedling－3，Wink seedling－12and Zhongshanhong germination of pollen tube，respectively；E－H represent SEM image of the mature pollen grain fromWink，Zhongshanhong，Wink seedlin－3and Wink seedlin－12，respectively；Red arrows stand for normal pollen；White arrows stand for abnormal pollen．

‘魏可实生－3’花粉囊壁由表皮层、药室内壁、中层和绒毡层组成，但结构层次不明显，围绕着中央的小孢子细胞，小孢子母细胞稀少、疏松（图版Ⅰ，6）；小孢子母细胞经过减数分裂后形成四分体，但从四分体游离出来的小孢子含量少，部分四分体的胼胝质不降解，小孢子不能正常游离出来，中层细胞已变成薄层，绒毡层细胞未降解，染色深（图版Ⅰ，7）；单核靠边期，表皮细胞变扁平，药室内壁细胞纤维状排列，但绒毡层才开始降解（图版Ⅰ，8）；双核期，绒毡层细胞未完全降解，花粉囊中出现空壳花粉（图版Ⅰ，9）；花粉成熟时，花粉粒大小不一，染色不均匀，绒毡层并没有降解完全，将花粉包围，花粉无法正常散出（图版Ⅰ，10）。

‘魏可实生－12’花药同样具有表皮层、药室内壁、中层和绒毡层结构，但结构不明显，花粉母细胞位于中央（图版Ⅰ，11）；小孢子母细胞形成四分体后，能够正常释放小孢子，绒毡层细胞已大部分降解，说明‘魏可实生－12’绒毡层细胞在小孢子释放前已经开始降解（图版Ⅰ，12）；单核靠边期，表皮细胞、药室内壁细胞正常发育，绒毡层细胞显著降解，还存在空壳花粉粒（图版Ⅰ，13）；小孢子细胞有丝分裂进入双核期，绒毡层几乎完全降解成薄层，花粉囊中含有空壳、染色较浅的花粉粒（图版Ⅰ，14）；花粉成熟期，绒毡层消失，花粉囊中花粉粒大小不一，染色浅，而且还存在空壳花粉粒（图版Ⅰ，15）。

图3 绒毡层发育相关基因的表达分析Ⅰ．减数分裂期；Ⅱ．单核早期；Ⅲ．单核晚期；Ⅳ．双核期；Ⅴ．成熟花粉期Fig．3 Expression analysis of the tapetum development related geneⅠ．Meiosis stage；Ⅱ．Mononuclear microspore stage；Ⅲ．Late mononuclear microspore stage；Ⅳ．Binuclear stage；Ⅴ．Mature stage

在‘魏可实生－12’的部分花药中发现不分化的细胞团，没有药室内壁、中层及绒毡层的分化，没有小孢子母细胞的形成，也没有小孢子的发生和发育（图版Ⅰ，16、17），试验中还发现没有花粉的空花粉囊，不具有可育花药的药室结构（图版Ⅰ，18）。‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’并不是所有的小孢子都发育异常，还有少部分小孢子能够正常发育，最终形成正常的成熟花粉粒（图版Ⅰ，19、20）。

2．5 绒毡层发育相关基因的表达分析

图3所示，在减数分裂期，‘魏可’的绒毡层发育相关基因DYT1、TDF1 表达量均最高，MYB4 最低，‘钟山红’的3个基因的表达情况与‘魏可’相反，‘魏可实生－3’‘和‘魏可实生－12’的表达水平均在‘魏可’与‘钟山红’之间；单核早期开始到花粉成熟，3个基因在‘魏可’中的表达水平一直均较低，‘钟山红’的DYT1 基因表达量一直最高，TDF1、MYB4基因表达水平一直最低，‘魏可实生－3’TDF1 基因在单核早期表达量最高，MYB4基因在单核晚期表达量最高，‘魏可实生－12’的TDF1基因在双核期表达量最高，MYB4基因表达水平一直最低。

3 讨 论

3．1 ‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’半不育特性的分析

‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’雄蕊花丝卷曲，花药中花粉量少，花粉萌发率仅10%左右，花粉存在2种形态，一种为正常长球形，含有萌发沟，另一种为异常近球形，不含萌发沟。正常花粉与‘魏可’（可育）形态相似，异常花粉与‘钟山红’（雄性不育）［31］相似，根 据 牛 立 新 等［27］、贺 普 超［32］对 葡 萄 雄性不育的描述，属于葡萄雄性不育类型。按照贺和初等［33］（水稻）对花粉育性的划分，‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’花粉萌发率10%左右，属半不育花粉，按照Raj等［34］的划分标准，属于部分不育花粉。

周时荣［35］研究发现w207－2半不育是由于Os－Kinesin－1基因中一个单碱基的突变造成了其编码的驱动蛋白中的一个与微管结合相关的关键氨基酸的改变，进而导致其不能正常地参与减数分裂过程中涉及染色体运动的联会、分离等过程，造成部分花粉缺失1条或多条染色体，并在单核期逐渐开始退化为没有任何内容物的空壳花粉，最终形成了花粉的半不育。‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’是‘魏可’自交后代性状分离得到的单株，小孢子细胞切片观察到‘魏可实生－3’在花粉成熟期仍有绒毡层包围，部分花粉粒异常，‘魏可实生－12’的绒毡层则在单核早期就大部分降解，单核晚期观察不到明显的绒毡层，最终药室内出现异常花粉，这可能是基因调控导致绒毡层发育异常，最终不能为花粉发育提供足够的营养，导致部分花粉不育。

3．2 ‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’小孢子败育的时期和原因分析

不同种植物、同一种植物不同品种雄性不育的败育机理都不尽相同，在花粉发育的所有阶段都可能发生败育，单子叶植物多数在单核至双核期，双子叶植物多发生在四分体至小孢子形成期［36］。目前大多数的研究发现，多数植物绒毡层发育不正常是导致花粉败育的一个主要原因。绒毡层是药室壁的最内层，包围着小孢子，在花粉形成和发育中起重要的作用：产生和输送给小孢子正常发育所需的酶类、激素类和营养物质；合成胼胝质酶，分解包围在四分体周围的胼胝质壁；提供构成花粉外壁的孢粉素。绒毡层发育和降解的异常，往往会影响小孢子的正常发育，有研究［37］认为花粉败育是由于绒毡层细胞在花粉形成和发育过程过度肥大液泡化、提前或延后退化。

本研究中‘魏可实生－3’、‘魏可实生－12’没有明显的药室壁结构，小孢子母细胞稀少、疏松，这可能与早期原生造孢细胞和平周细胞的分化异常有关［38］。‘魏可实生－3’双核期绒毡层未完全降解，一直到花粉成熟期还存在，包围着成熟的花粉粒，绒毡层细胞中的营养滞留其中，没有及时供应小孢子的发育，引起后期小孢子的败育，部分花粉粒异常。‘魏可实生－12’绒毡层细胞在单核早期就大部分降解，过早降解导致营养供应异常，部分小孢子败育，这与刘倩等［16］在‘钟山红’小孢子发育的单核早期观察到的现象一致。

本研究中还发现没有花粉的空花粉囊（图版Ⅰ，17），罗来水等［6］对桃树23个品种花粉发生发育和花粉败育过程中细胞形态学上的变化特征研究，发现了相似的现象，指出在花粉处于单核晚期－二核早中期绒毡层细胞发生液化、增生现象和花粉母细胞减数分裂不正常是导致大多数桃树品种产生空粒花粉的主要原因。但本研究中‘魏可实生－12’小孢子发育的单核晚期－二核早期中并未观察到绒毡层液化、增生现象，空花粉囊可能是因为绒毡层提前解体，无法正常分泌胼胝质酶，小孢子很难从四分体中游离出来，而且绒毡层细胞中营养物质流失，无法为小孢子正常发育提供营养。

3．3 ‘魏可实生－3’和‘魏可实生－12’绒毡层发育异常的基因调控分析

DYT1（DYSFUNCTIONAL TAPETUM1）编码一个在花药发育早期表达的basic helix－loop－helix（bHLH）家族转录因子，控制着绒毡层特异基因的表达，在花药发育前期的绒毡层中强烈表达，DYT1突变体绒毡层细胞出现异常的空泡化和肥大，无法转为分泌型细胞，导致小孢子提前降解，完全 雄 性 不 育［39］；TDF1（DEFECTIVE IN TAPETAL DEVELOPMENT）是一个在绒毡层、花粉母细胞和小孢子中强烈表达的MYB 家族的转录因子，调控了绒毡层细胞的分裂以及正常的分泌功能，是控制胼胝质解体的重要元件，tdf1突变体表型类似于dyt1，绒毡层细胞无法进一步分化为分泌型的细胞，不能正常分泌胼胝质酶，最后胼胝质无法降解使 小 孢 子 聚 集 在 花 粉 囊 中，完 全 败 育［40］；At－MYB103在拟南芥绒毡层中特异性表达并对绒毡层功能起重要作用，编码MYB 家族转录因子，其突变体atmyb103花药发育过程中绒毡层提早降解和花粉 畸形［41］，葡 萄 中 的MYB4 基 因 是AtMYB103 的同源基因，均属于MYB 转录因子家族，具有相同的结构功能域。

本研究中，从‘钟山红’单核早期到花粉成熟，DYT1基因的表达水平一直较高，它的过量表达抑制了下游TDF1基因的表达，进而导致了下游MYB4基因减数分裂期超量表达，从而影响绒毡层发育，‘钟山红’绒毡层提前降解［16］；‘魏可实生－3’DYT1基因在减数分裂期表达量远低于‘魏可’，TDF1基因在单核早期表达量最高，DYT1基因表达量不足抑制下游TDF1基因在减数分裂期的表达，而TDF1基因单核早期的过量表达导致下游MYB4基因在单核早期表达量异常增加，导致绒毡层延迟降解；‘魏可实生－12’DYT1基因在减数分裂期表达量低于‘魏可’，DYT1基因减数分裂期的表达量不足导致了TDF1基因在双核期、花粉成熟期过量表达，最终下游MYB4基因过量表达，绒毡层提前降解。同时TDF1基因还是控制胼胝质解体的重要元件，TDF1异常表达不仅会影响绒毡层降解，而且还会影响绒毡层分泌胼胝质酶，导致胼胝质壁无法正常解体，进而影响小孢子的释放，‘魏可实生－12’观察到的空花粉囊可能与TDF1基因双核期过量表达有关。DYT1、TDF1、MYB4基因编码蛋白调控绒毡层发育的具体作用机理还有待 于进一步研究探讨。

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图版Ⅰ 魏可实生－3和魏可实生－12花药和小孢子发育观察E．表皮层；En．室内壁；ML．中层；T．绒毡层；Td．四分体；PMC．花粉母细胞（小孢子母细胞）；PG．花粉粒1～15．花药和小孢子发育过程：1～5．魏可；6～10．魏可实生－3；11～15．魏可实生－12；16、17．魏可实生－12未发育的孢原细胞团；18．魏可实生－12空花粉囊；19．魏可实生－3成熟花粉粒（正常）；20．魏可实生－12成熟花粉粒（正常）。PlateⅠ The results of anther and microspores development E．Epidermis；En．Endothecium；ML．Middle layer；T．Tapetum；Td．Tetrad；PMC．Microspore mother cell；PG．Pollen grain Fig．1－15．The development of anthers and microspores：Fig．1－5．Wink；Fig．6－10．Wink seedling－3；Fig．11－15．Wink seedling－12；Fig．16，17．Wink seedling－12undeveloped archesporial cell；Fig．18．Wink seedling－12empty anther；Fig．19．Wink seedling－3 mature pollen grains（normal）；Fig．20．Wink seedling－12mature pollen grains（normal）．