铁皮石斛茎段离体快繁研究进展

朱启发+朱亚雄

摘 要：铁皮石斛是具有药用价值及经济价值的名贵草药。该文对近年来铁皮石斛以芽繁芽离体快繁相关研究情况进行了整理与分析，从外植体的预处理与灭菌方法、基本培养基的选择、植物生长调节剂等方面进行了综述。

关键词：铁皮石斛；以芽繁芽；离体快繁

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）08-37-03

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为我国传统草药，是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）植物，以干燥茎入药。是有药用价值及经济价值的名贵草药，2010年版《中国药典》将铁皮石斛从石斛中单独列出。因其原生地生境破坏和常年过度采挖，铁皮石斛野生资源遭到严重破坏，濒临灭绝，已列入中国珍稀濒危保护植物名录[1]。利用植物组织培养技术建立其离体快繁体系是获得大量种苗的有效途径。研究表明，带芽茎段具有分生能力强的特点，作为组织培养的外植体，不经过愈伤组织阶段，直接萌发出芽，有利于保持该品种遗传性状稳定，是最理想的外植体[2]。为此，笔者将近年来铁皮石斛以芽繁芽离体快繁相关研究情况进行了整理与分析，从外植体的预处理与灭菌方法、基本培养基的选择、植物生长调节剂等方面进行了综述，以期能为铁皮石斛组织培养规模化生产提供理论基础及技术参考。

1 外植体的预处理与灭菌方法

目前研究者们在采用铁皮石斛带芽茎段进行组培快繁时，使用的表面灭菌技术主要包括：选择生长旺盛的铁皮石斛幼嫩枝条，剥去节上叶片和膜质叶鞘，先用洗洁精或洗衣粉清洗后，用水龙头下用自来水冲洗30～40min，滤干水分，将嫩枝剪成约1.5cm长带茎节的小段，放入烧杯中在超净工作台中进行灭菌。灭菌采用常规方法，即75%酒精+0.1%升汞溶液的灭菌组合，75%酒精浸泡时间为35s，接着用0.1%升汞溶液浸泡，浸泡时间为10min，2次灭菌间隔用无菌水漂洗1次，灭菌结束后用无菌水漂洗4～5次，最后将经无菌滤纸吸干表面水分的外植体接种到适宜的腋芽诱导萌发培养基中[3-5]。经过上述灭菌方法处理后，外植体携带的微生物基本被清除，能够达到较好的灭菌效果。

2 基本培养基的选择

选择何种基本培养基的是影响植物组织培养快速繁殖的重要因素。MS、B5、SH和White是常用的兰科植物组织培养基，曹天旭等选择这4种基本培养基研究不同基本培养基对铁皮石斛生长的影响，试验结果显示，在MS和SH培养基中，铁皮石斛的成苗数、鲜重和干重显著高于White和B5培养基，两者之间无显著差异，但相比SH培养基，MS培养的铁皮石斛试管苗颜色深绿，生长旺盛，芽数分化最多。综合各项生长指标，MS基本培养基为营养成分比较全面的培养基，符合铁皮石斛丛生芽的诱导和生长要求，为其最适培养基[6]。马玉申等进行外植体腋芽诱导影响的对比试验，从4种不同浓度的MS（MS、1/2MS、1/3MS和1/4MS）培养基中筛选铁皮石斛组培快繁最适宜的基本培养基。结果显示，铁皮石斛芽在MS基本培养基中萌发率极低（7.5%），褐化严重而致外植体死亡；1/2MS培养基中，腋芽诱导率最高，达到65.0%，萌发的芽叶色翠绿、茎径较粗，和其他3种培养基相比，芽的长势最好；1/3MS和1/4MS培养基中的外植体，腋芽不萌发，绝大部分死亡[3]。目前在铁皮石斛快繁技术的研究中一般采用MS或1/2MS培养基做为基本培养基[7-9]。

3 植物生长调节剂的影响

生长调节剂在植物组培快繁体系建立的过程中起着关键的作用。在植物组织培养中，生长素单独使用时，主要起到促进细胞生长和伸长及根的分化的作用[10]，而单独使用细胞分裂就能起到促进芽萌发的增殖的效果，但同时添加生长素和细胞分裂素，两者的联合作用对组培苗的生长更有利，更能促进侧芽的萌发和生长[11]。在培养过程中，生长素和细胞分裂素的种类及浓度是影响组培苗快繁的关键因素之一。在铁皮石斛以芽繁芽离体快速繁殖体系建立过程中，增值培养基可以和诱导培养基相同，一般采用6-BA和NAA组合居多，NAA浓度一般为0.2～1.0mg/L，6-BA浓度一般为0.5～3mg/L；生根阶段一般采用IBA和NAA，IBA浓度为0.2～3.0mg/L，NAA浓度一般为0.2～0.5mg/L[12-15]。细胞分裂素KT也常被添加到培养基中用于铁皮石斛组织培养离体快繁技术的研究，洪森荣等的研究试验结果显示，培养基中添加的KT浓度一定的情况下，在一定浓度范围内，添加NAA浓度越高，铁皮石斛带芽茎段的增殖率越高，且芽增值率的高低与KT与NAA的浓度配比高低成正比[16]。多效唑是一种高效、低毒的植物生长延缓剂，且有广谱杀菌作用[17]。在植物离体快繁体系建立中，主要用于壮苗和促进试管苗生长以及生根，蒙爱东等将多效唑用于铁皮石斛试管苗培养，试验效果好，适宜浓度的多效唑起到壮苗、促进试管苗生根以及提高移栽成活率的作用[18]。

4 影响铁皮石斛以芽繁芽离体快繁的其他因素

4.1 添加物 在建立植物组培快繁体系研究中，常在不同阶段培养基中添加附加物以达到提高产物产量的目的。选择的添加物其有效成分多为氨基酸、酶、植物激素等物质，常用的添加物有马铃薯泥、香蕉泥、甘薯汁、冬瓜汁、木瓜乳、南瓜汁和椰乳等，多数研究证明它们能明显促进组培苗的增殖和分化[19]。罗焕明等研究试验结果得出马铃薯汁和木瓜乳有利于诱导铁皮石斛组培苗芽的增殖，香蕉乳有利于诱导组培苗生根。试验中还发现加入活性炭可以促进根系生长，利于试管苗的生长[20]。李霖明等研究分别在培养基中添加壳聚糖、绿丰源、海藻精和极可善对铁皮石斛组培苗生长的影响，试验结果表明，在相同的培养条件下，不同添加物对组培苗生长影响不同，极可善和壳聚糖有利于铁皮石斛壮苗和促进试管苗生根；在增殖阶段，添加极可善和海藻精可以提供铁皮石斛组培苗增殖率[21]。

4.2 pH值 培养基的pH亦是影响铁皮石斛离体组培快繁的关键因素，植物组织培养pH一般以5.0～6.0较适宜，pH高于6.0时，培养基硬度高，不利于外植体吸收养分；pH低于5.0时，培养基太软，甚至不凝固，不利于外植体固定[22]。一般情况下铁皮石斛组培的适宜pH范围在5.6～5.8之间，pH过高或过低都会影响铁皮石斛组培苗的生长。

4.3 琼脂和碳源 在进行植物组织固体培养时，琼脂是良好的固化剂。植物组织培养基中使用琼脂的一般浓度为0.3%～1%，因为不同厂家生产的琼脂质量不同会导致培养基凝固的适宜浓度不同，所以在使用前应进行不同琼脂浓度的预实验加以确定。铁皮石斛组织培养中添加琼脂浓度一般为0.4%～0.7%。植物本来能够进行光合作用，合成碳水化合物，满足自身生长的能量需求，不需要从外部供给糖。可是植物组织在离体后，依靠自养作用制造的碳水化合物难以满足自身需求，必须从培养中吸收碳水化合物。蔗糖相对于其他碳源不仅价格低廉、购买方便，而且能满足绝大多数植物离体培养所需的碳源[23]。目前，大部分植物组织培养试验研究或者工厂化生产都选择蔗糖作为碳源[24]。铁皮石斛的离体组培快繁也采用糖作为碳源，其使用浓度范围一般为2%～3%。

4.4 培养条件 组培苗的正常生长也像生长在自然界中的植物一样依赖适宜的温度和光照等培养条件。适宜组培苗生长的温度一般在25～30℃，不同的品种的最适宜温度差别很大[25]。光质、光照强度和光照时间长短都影响铁皮石斛组培苗的生长。在铁皮石斛组织培养中，培养室的培养条件一般设置为：温度（25±1）℃，每天光照12h，光照强度1 000～2 000lx。

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（责编：徐焕斗）