燃料乙醇生产中低聚糖及有机酸的HPLC分析及应用效果

郑伟，杨维旭，李冬梅，谭洪波，刘春景，孔令新（吉林燃料乙醇有限责任公司，吉林吉林 132101）

燃料乙醇生产中低聚糖及有机酸的HPLC分析及应用效果

郑伟，杨维旭，李冬梅，谭洪波，刘春景，孔令新（吉林燃料乙醇有限责任公司，吉林吉林 132101）

在燃料乙醇生产过程中，采用高效液相色谱（HPLC）对低聚糖及有机酸进行监测；探讨了HPLC法的跟踪效果，并对有问题的发酵结果进行了分析。结果表明：对发酵液开展HPLC检测，在生产工艺的优化及决策上效果理想，可满足过程监控的需求。

燃料乙醇；低聚糖；有机酸；发酵液；糖化酶；酵母；染菌

在燃料乙醇的生产中，成熟的发酵技术就是严格的过程控制，体现的是从低聚糖到发酵产物并形成有机酸的过程，而过程控制的实现，需要对过程参数进行合理选取和有效监测。其中低聚糖及有机酸的监测是掌握生产中通过酵母的发酵将糖转化为乙醇的必备手段；组分能够被及时、准确的检测，可充分表达发酵工序运行状态，对避免染菌、使乙醇收率最大化起到指导性作用。

在燃料乙醇的生产上，国内仍沿续着常规的化学方法监测工艺过程，对发酵工艺指标还局限在还原糖、挥发酸、残总糖的层面上，而国外（如美国Corn Plus及Renew Energy燃料乙醇公司）已采用高效液相色谱（HPLC）法分析，是对发酵过程更为精细化和最为直接的分析方法；通过测定低聚糖［（低聚糖4-10糖）、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖］、有机酸、醇（乳酸和丙三醇、醋酸）、发酵目标产物（乙醇）等含量，可非常直观地表达工艺中各罐的发酵状况，最终确定工艺参数。这些精细化指标对工艺的运行条件更为具体、实用，这不仅仅是检测仪器或分析方法的提升，更是对生产工艺管理的促进［1］。

吉林燃料乙醇有限责任公司质检中心自2004年起，参照Cerestar、Corn Plus及Renew Energy公司的检测方法，对发酵醪液开展了HPLC的全程监测，在合理控制糖化酶用量、发酵温度，避免酵母抑制以及染菌对酵母产生的竞争性抑制上，效果较为理想，为生产工艺的优化及决策提供了更为科学的数据依据。

1 实验

1.1 试剂及仪器

麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、乳酸锂、丙三醇、醋酸钠、无水硫酸钠、乙醇，均为色谱纯，Sigma Aldrich化学公司［2］。

Flexar LC10系统，Perkin Elmer公司，软件Chromera Manager Ver 4.1.0.6386，phenomenex REZEXTMROA Organic Acid色谱柱（300 mm×7.8 mm，8μm），AJO-4490预处理柱（50 mm×7.8 mm，8μm）。

1.2 方法

1.2.1 低聚糖及有机酸标准样品浓度

分别准确称取8种标准品置于100 mL容量瓶中，用流动相（0.0025 mol·L－1H2SO4）溶解并定容，配制成标准品系列溶液及混合标准品溶液；混合标准品溶液浓度见表1。

1.2.2 样品预处理

为避免酶解及发酵的持续进行，需检测发酵醪液的初始pH值。用65%H2SO4将醪液pH值调至1.0～1.5，4 000 r·min－1离心5min。取上清液50mL，定容到100 mL，0.22μm水系滤头过滤至色谱样品瓶中，自动进样，进行HPLC分析。

表1 低聚糖及有机酸混合标准品溶液浓度/［g·（100 m L）－1］Tab.1 Concentration of oligosaccharides and organic acid m ixed standard solution

1.2.3 色谱条件

流动相为0.0025mol·L－1H2SO4，流速0.6mL· min－1，柱箱温度65℃，RID温度50℃，进样量20μL，运行时间25 min。

1.2.4 低聚糖及有机酸定性、定量方法

先以保留时间、样品加标来进行定性；再以峰面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 低聚糖及有机酸标准曲线的回归方程和线性范围（表2）

表2 混合标准品溶液的回归方程和线性范围Tab.2 Regression equation and linear range ofm ixed standard solution

2.2 燃料乙醇生产中发酵液的液相色谱（图1）

图1 发酵液的HPLC图谱Fig.1 HPLC Spectrum of fermentation liquid

由图1、表2可知，发酵液中各组分分离度较好，含量线性范围涵盖合理，相关性较高，满足方法的适用性要求。

在对发酵液进行HPLC分析时，组分中会分离出其它的发酵产物；其中，阿拉伯糖、丁二酸、甲醇系发酵过程中正常产物，对发酵影响不大；果糖系液化过程中淀粉链还原端的一些葡萄糖单元在高pH值和高温的联合作用下异构生成。发酵液中重点关注的组分：（低聚糖4-10糖，合峰）、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、乳酸、丙三醇、醋酸、乙醇。

2.3 HPLC对发酵过程的跟踪应用首先，在发酵早期监控分布，可让工艺人员了解淀粉酶将淀粉转化成可发酵糖的程度，并确定投酵母的具体时间。其次，后面出峰的组分（乳酸、丙三醇、醋酸和乙醇）代表在发酵期间所产生的有机酸和乙醇。监控这些组分，可便于工艺人员确认发酵终点；并指导工艺人员添加严格控制的限量抗生素，来抑制细菌的污染，及防止其它可能导致抑制乙醇生产的情况发生［3］。

2.3.1 理想的发酵状态

利用HPLC监测发酵过程，理想的发酵结果见表3。

在进行HPLC分析的同时，将HPLC的分析结果同发酵温度、酵母的活细胞数及出芽率相结合，对燃料乙醇生产具有更好的指导效果。

表3 理想的发酵结果Tab.3 Data of ideal ferm entation

2.3.2 有问题的发酵结果

利用HPLC对发酵过程进行跟踪分析，有问题的发酵结果见表4～7。

1）糖化酶用量

表4 有问题的发酵结果1Tab.4 Problem ferm entation data 1

表5 有问题的发酵结果2Tab.5 Problem fermentation data 2

2）发酵温度

表6 有问题的发酵结果3Tab.6 Problem fermentation data 3

分析表6结果可知，发酵过程存在的问题为较高的发酵温度、较慢的酵母利用葡萄糖的速率、较高的丙三醇数值、低的乙醇产率、较高的有机酸、较低的出芽率和活细胞数。原因可能是发酵温度过高造成酵母生长受抑制。因此，应采用较低的发酵温度32～33℃。

3）染菌

表7 有问题的发酵结果4Tab.7 Problem fermentation data 4

分析表7结果可知，发酵过程存在的问题为较慢的葡萄糖利用效率、较高的有机酸、较低的乙醇产率、较低的出芽率和活细胞数。原因可能是染菌造成对酵母的竞争性抑制。因此，在酵母培养和发酵罐中应添加抑菌剂。

3 结语

1）通过HPLC法对燃料乙醇生产中的发酵液进行低聚糖及有机酸的检测分析，是过程控制的最为有效的手段，其多组分分离的方法直观、简便、快速、准确；为生产装置平稳运行提供了准确数据信息，实现了过程质量管理及控制的动态分析。

2）依据HPLC检测发酵不同时间段数据的累积，可有效掌握液化、糖化工序、酶作用底物的效果，了解淀粉在整个乙醇生产工艺的水解程度和水解产物特性，能更直观地表达发酵过程中各罐的发酵状况；为掌握酶作用底物效果，酵母的充分利用等生产运行状态，确定合理工艺参数，避免罐内物料染菌，提高转化率，可以起到很好作用效果，是生产、工艺管理者及操作者理想的控制资料和数据，具有重要的指导价值和现实意义。

［1］MCGINLEYM，MOTT J.Ethanol Production Monitoring Using Ion Exclusion Hplc.

［2］杨毅，李崎，陈蕴，等.反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定啤酒中有机酸［J］.食品与发酵工业，2003，29（8）：6-12.

［3］刘文信.HPLC在酒精发酵醪液检测中的应用［J］.化学工程师，2013，（2）：28-30.

HPLC Analysis and App lication Effect of O ligosaccharides and Organic Acid in the Production of Fuel Ethanol

ZHENG W ei，YANG W ei-xu，LIDong-mei，TAN Hong-bo，LIU Chun-jing，KONG Ling-xin
（Jilin Fuel Alcohol Company Limited，Jilin 132101，China）

The content of oligosaccharide and organic acid in the production process of fuel ethanolwas determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.The tracking effect of HPLC was discussed，and the problem of fermentation data were analyzed.The results showed that，HPLC analysis of fermentation liquid was ideal in the production process optimization and decision making，and met the requirements of processmonitoring.

fuel ethanol；oligosaccharides；organic acid；fermentation liquid；saccharifying enzyme；yeast；bacterial contamination

TQ 923 O 657.72

A

1672-5425（2015）07-0067-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.07.018

2015-03-05

郑伟（1965－），女，吉林省吉林市人，硕士，高级工程师，主要从事燃料乙醇的质量管理，E-mail：zhengw.jfa@cnpc.com.cn；通讯作者：杨维旭，高级工程师，E-mail：yangwx.jfa@cnpc.com.cn。