三种药物对CIA大鼠滑膜细胞凋亡与基因表达的影响①

王建业,张天英，乔晓峰，李长德

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

三种药物对CIA大鼠滑膜细胞凋亡与基因表达的影响①

王建业,张天英，乔晓峰，李长德

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：通过实验观察正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片对CIA大鼠滑膜细胞凋亡与基因表达影响,探讨正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片治疗作用机理。方法：采用随机分组，①正常对照组：Wistar大鼠，清洁级，没有造模12只，喂饲普通饲料，灌胃生理盐水1mL/100g·d；②类风湿性关节炎模型组( 以下简称模型组)：造模成功Wistar大鼠12只，灌胃生理盐水1mL/100g.d；③正清风痛宁缓释片组：高剂量组：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃正清风痛宁缓释片药液120mg/100g·d,低剂量组：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃正清风痛宁缓释片药液30mg/100g·d；④白芍总苷胶囊组：高剂量组：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃白芍总苷胶囊药液50mg/100g·d,低剂量组：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃白芍总苷胶囊药液10mg/100g·d；⑤万通筋骨片组：高剂量组：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃万通筋骨片药液60mg/100g·d, 低剂量组：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃万通筋骨片药液8mg/100g·d，五组给药48d。结果：正清风痛宁缓释片高、低剂量组,白芍总苷胶囊高、低剂量组,万通筋骨片高、低剂量组滑膜细胞凋亡的数量上明显高于造模组，CIA大鼠滑膜细胞造模组高于正清风痛宁缓释片高、低剂量组,白芍总苷胶囊高、低剂量组,万通筋骨片高、低剂量组组，CIA大鼠滑膜细胞造模组高于正清风痛宁缓释片高、低剂量组,白芍总苷胶囊高、低剂量组,万通筋骨片高、低剂量组组。结论：正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片对CIA大鼠滑膜细胞可以起到很强的诱导凋亡作用。

正清风痛宁缓释片； CIA大鼠；细胞凋亡

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis RA)是一种病因未明慢性以炎性滑膜炎为主自身免疫性疾病，类风湿性关节炎病变主要发生在滑膜。类风湿性关节炎病理变化是滑膜衬里细胞增生与间质炎性细胞浸润及微血管新生和血管翳形成，致使关节中软骨和骨组织破坏。胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型是研究类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis RA)发病机制实验动物模型。本实验比较正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片对CIA大鼠滑膜细胞凋亡与基因表达影响，探索从滑膜细胞凋亡去研究中药治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis RA)机制。类风湿性关节炎病变关节与正常关节对比，早晨僵硬明显，下午减轻明显，刚开始活动疼痛较重，活动多时僵硬减轻或消失。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

①药物：正清风痛宁缓释片(湖南正清制药集团股份有限公司，批准文号：国药准字Z20010174)主要成分青藤碱 ，具有除湿祛风，通络活血，止痛消肿；白芍总苷胶囊(宁波立华制药有限公司，批准文号：国药准字H20055058)主要成分白芍总甙；万通筋骨片(通化万通药业股份有限公司，批准文号：国药准字Z20025183)主要成分川乌(制)、草乌(制)、马钱子(制)等二十五味中药[3～5]。

②试剂：胶原蛋白II型/Collagen Type II(南京奥多福尼生物科技有限公司，CAS 900734，批号200326)；弗氏不完全佐剂/Freund’s Adjuvant Complete(mpbio公司，批号08642862)；10%中性福尔马林；EDTA 缓冲液(上海百赛生物技术有限公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海前尘生物科技有限公司)。

③实验动物：Wistar大鼠，清洁级，60只，体重(100±20)g，佳木斯大学实验动物中心提供。

④仪器设备：奥林巴斯(OLYMPUS)CH-2双目显微镜(上海维翰光电科技有限公司)、TKY-TSH(1600mL)生物组织智能脱水机(湖北泰康医疗设备有限公司)、康龙KL型生物组织组织包埋机(湖北康龙电子科技有限责任公司)、JJQ-P2016A生物组织切片机(武汉俊杰电子有限公司)、QIQIAN/启前HH-600三用恒温水箱(上海启前电子科技有限公司)、整支消毒手动单道可调式移液器(上海荣泰生化工程有限公司)。

1.2 实验方法[1，2]

1.2.1 类风湿性关节炎大鼠模型建立： Wistar大鼠，清洁级，50只，体重(100±20)g，采用0.1M醋酸溶解胶原蛋白II型/Collagen Type II (2mg/mL,4℃,12h),Wistar大鼠尾根部皮下注射0.2mg胶原蛋白10d模型成功。

1.2.2 实验分组与正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片给药：采用随机分组，①正常对照组：Wistar大鼠，清洁级，没有造模12只，喂饲普通饲料，灌胃生理盐水1mL/100g·d；②类风湿性关节炎模型组( 以下简称模型组)：造模成功Wistar大鼠12只，灌胃生理盐水1mL/100g·d；③正清风痛宁缓释片组：高剂量组：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃正清风痛宁缓释片药液120mg/100g·d, 低剂量组：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃正清风痛宁缓释片药液30mg/100g·d；④白芍总苷胶囊组：高剂量组：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃白芍总苷胶囊药液50mg/100g·d, 低剂量组：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃白芍总苷胶囊药液10mg/100g·d；⑤万通筋骨片组：高剂量组：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃万通筋骨片药液60mg/100g·d, 低剂量组：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃万通筋骨片药液8mg/100g·d，五组给药48d，五个处理Wistar大鼠断头处死，膝关节取滑膜组织,放入10%中性福尔马林液中固定、康龙KL型生物组织组织包埋机石蜡包埋，JJQ-P2016A生物组织切片机切片，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒原位细胞凋亡检测和基因表达。

1.2.3 细胞凋亡检测采用碱性磷酸酶标记法，免疫组织化学检测基因表达结果。

1.2.4 正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片免疫组织化学检测p53基因表达结果判定标准，见表1。

表1 正清风痛宁缓释片等对CIA大鼠滑膜细胞凋亡和基因表达结果判定标准

1.3 统计学方法

2 结果

正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片组CIA大鼠滑膜细胞凋亡和基因表达，见表2。正清风痛宁缓释片高、低剂量组,白芍总苷胶囊高、低剂量组,万通筋骨片高、低剂量组滑膜细胞凋亡的数量上明显高于造模组(P<0.05)。基因表达方面,造模组远远高于各组(P<0.05)。

表2 正清风痛宁缓释片等对CIA大鼠滑膜细胞凋亡和基因表达±s)

注：与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05。

3 讨论

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis RA)是以炎性滑膜炎病变为主原因不明的自身免疫性疾病，主要在关节滑膜衬里细胞增生与间质炎性细胞浸润及微血管新生和血管翳形成，致使关节中软骨和骨组织破坏。

本研究发现正清风痛宁缓释片高、低剂量组,白芍总苷胶囊高、低剂量组,万通筋骨片高、低剂量组滑膜细胞凋亡的数量上明显高于造模组。CIA大鼠滑膜细胞造模组高于正清风痛宁缓释片高、低剂量组,白芍总苷胶囊高、低剂量组,万通筋骨片高、低剂量组组。CIA大鼠滑膜细胞造模组高于正清风痛宁缓释片高、低剂量组,白芍总苷胶囊高、低剂量组,万通筋骨片高、低剂量组组。

正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片通过研究可以明显抑制滑膜细胞增殖和滑膜炎症细胞浸润。可以明显诱导更多的类风湿性关节炎滑膜细胞凋亡。类风湿性关节炎的滑膜细胞凋亡机制复杂，影响调控因素很多，正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片诱导细胞凋亡途径要从相关蛋白和基因表达去探索。

通过正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片对CIA大鼠滑膜细胞凋亡与基因表达研究，实验证明正清风痛宁缓释片与白芍总苷胶囊及万通筋骨片对CIA大鼠滑膜细胞可以起到很强的诱导凋亡作用，为青藤碱和白芍总甙在临床上治疗类风湿性关节炎提供了实验和理论依据。

[1]代淑华，江清林，辛华，等. 茶黄素和脑血通口服液治疗大鼠动脉粥样硬化的实验研究[J]. 安徽医科大学学报，2013，48(10)：1198-1200

[2]黄展，李春丰，王晶，等. 白头翁正丁醇提取物对小鼠肝损伤保护研究[J]. 黑龙江医药科学，2014，37(2)：57-58

[3]国家药典委员会中国药典，一部[s]北京:化学工业出版社，2005，135

[4]傅绍萱.青藤碱的药理作用Ⅱ[J]．药学学报，1963，10(11):673

[5]陈惠红.青藤碱制剂的临床应用及实验研究进展[J]．实用中医药杂志，2006，22(5):317

黑龙江省卫生厅科研项目，编号：2012-215。

王建业(1969～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师，硕士研究生导师。

张天英(1971～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任药师。E-mail:zty-000@163.com。

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1008-0104(2015)01-0076-02

2014-11-12)