基于致香成分的重庆主要烟草种植区溯源特征研究

刘建利，陈 涛，朱晓伟，王 茜，杨式华，袁天军，侯 英

(1 中国烟草总公司 重庆市公司，重庆 400023；2 重庆烟草质量监督检验站，重庆 400023；3 云南同创检测技术股份有限公司，云南 昆明 650106)

基于致香成分的重庆主要烟草种植区溯源特征研究

刘建利1，陈 涛1，朱晓伟1，王 茜2，杨式华3，袁天军3，侯 英3

(1 中国烟草总公司 重庆市公司，重庆 400023；2 重庆烟草质量监督检验站，重庆 400023；3 云南同创检测技术股份有限公司，云南 昆明 650106)

【目的】 以烤烟中多项致香成分含量为原始数据，采用多元统计分析方法对重庆烟叶产地溯源的可行性进行研究，筛选出判别烤烟产地溯源的有效指标。【方法】 利用GC-MS法，检测采自重庆主要烟草种植区(武陵山区、渝中渝西地区、三峡库区和渝东北秦巴山区)4个品种(云烟87、云烟97、K326和贵烟四号)147份烤烟样品中70项致香成分的含量，对试验数据进行方差分析、主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)、变量重要性因子(VIP)和逐步回归判别分析，逐步筛选出可用于判别烟叶产地溯源的有效指标，建立判别模型，并对模型判别正确率进行检验。【结果】 来源于重庆不同地区烟叶样品的致香成分含量具有一定的差异。通过方差分析、PCA、PLS-DA、VIP法和逐步回归判别分析，从70项致香成分中筛选出苯乙醇、3-甲基-2-丁烯醛、2-吡啶甲醛、4-吡啶甲醛、糠酸、3-羟基-2-丁酮、面包酮、1-(3-吡啶基)-乙酮、胡薄荷酮、β-紫罗兰酮和亚麻酸甲酯11项，用于有效判别烤烟产地溯源的指标，用11项指标所建立的判别模型对烤烟样品回代检验判别正确率为92.5%，交叉检验判别正确率为90.5%。【结论】 将致香成分含量与多元统计分析方法结合可用于烤烟产地溯源。

烤烟；致香成分；重庆；溯源特征；GC-MS

烟草是一种对环境极为敏感的经济作物，烟叶香气的表现型由遗传因素和环境因素共同决定，在不同的环境条件下，不同烤烟品种或相同品种致香成分的组成、含量和比例不尽相同[1-5]。研究表明，生态条件对初烤烟叶的致香成分影响较大，是烤烟香气风格特征形成的主导因素，其中气候和土壤等生态环境条件对烟草田间长势、烟叶产值、产量、致香成分含量以及评吸质量的影响大于品种因素[6-12]，致使不同生态产区之间烟叶香气和香味具有丰富的多样性[1]，这为致香成分对产地溯源性研究提供了基础依据。烟叶致香成分含量和组成比例主要受环境因素的影响，不同环境因子条件下种植烟叶的致香物质组分具有一定差异，利用致香成分分析判别烟叶产地已有部分报道[13-14]，但利用致香成分对烟叶产地溯源的研究尚未见报道。本研究从重庆烟叶主产区采集样品，分析重庆不同地区来源烟叶样品中致香物质的分布特征，探讨致香成分多元统计分析技术对重庆烟叶产地溯源的可行性，筛选出可用于判别烟叶产地溯源的有效指标，为重庆烟叶产地鉴别、风格特色区划奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

基于黎莉莉等[15]的重庆市农业功能区划研究结论，从重庆主要产烟区采集2012年初烤烟叶样品147份(其中每个产区均含B2F、C3F、X2F 3个等级，每个等级各49份)，每个地区取样品种主要为云烟87、云烟97、K326和贵烟四号，采样地点和份数见表1。

表1 重庆主要烟草种植区烟叶采样地点和份数Table 1 Sampling sites and number of tobacco samples from main tobacco planting areas in Chongqing

1.2 方 法

1.2.1 样品的采集 选取农户于采收期初烤的代表性烟叶样品2.0 kg，编号，作为1个样品。从样品中取200.0 g 烟叶粉碎，充分混匀后取100.0 g烟末(过0.25 μm筛)，封装，作为分析样本备用。

1.2.2 样品预处理 准确称取备用样25.0 g，每个样本平行3份，置于恒温恒湿箱(温度22 ℃、相对湿度60%)平衡24 h，之后采用同时蒸馏萃取法对样品进行处理，萃取剂为二氯甲烷，将盛有烟末的一端加入350 mL蒸馏水置于电热套上加热，另一端加入30 mL二氯甲烷置于水浴锅中加热，水浴锅温度为60 ℃，同时蒸馏萃取2 h。萃取完成后，采用旋转蒸发仪(压力为560 mPa、转速为65 r/min)将萃取液浓缩至1.0 mL，装入样品瓶中待测。

1.2.3 致香成分含量测定 致香成分含量的测定采用GC-MS法，使用气质联用分析仪(Agilent GC6890N/MS5975Ⅰ)对 1.2.2 节的萃取浓缩液进行分析，以萘为内标物，所得图谱经计算机谱库(NIST05,Wiley275)检索，按照文献[16]的方法计算各物质的含量。检测指标：醇类10项，醛类14项，酮类22项，酸类3项，酯类7项，酚类6项，杂环类7项，新植二烯1项，共70项指标。

1.3 数据处理

采用SIMCA-P+11.5软件(瑞典，UMETRICS)对数据进行自标度化(UV)处理后[17-19]，进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，并利用变量重要性因子(Variable importance in the projection，VIP)对指标进行筛选分析[20]。其计算公式如下:

(1)

(2)

(3)

式(1)中：VIPj表示第j个自变量xj的重要性因子，P表示自变量的个数，m为提取的有效成分个数，Whj为轴Wh的第j个分量；式(2)中：Rd(Y;th)表示主成分th对因变量Y的解释能力，r(Y;th)是因变量Y和主成分th的相关系数；式(3)中：Rd(Y;t1,t2,…,tm)表示m个成分t1，t2，…，tm对Y的累计解释能力。

VIP值反映的是所有自变量X(致香成分指标)对于因变量Y(分类)的解释能力，VIP值越大，X对Y的解释能力越强，VIP值>1的变量具有较大的相关性，对于Y的解释具有重要贡献。统计分析使用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0，逐步分析采用Fisher逐步判别[21],进入模型的F=3.84,移出模型的F=2。

2 结果与分析

2.1 烤烟中致香成分含量的差异分析

对重庆不同产区烤烟中70种致香成分含量进行多重比较，结果表明，除2,4-庚二烯醛B、1-(2-呋喃基)-乙酮、金合欢基丙酮B和新植二烯4项指标在不同产区间无显著性差异外，其余指标在不同产区间均具有显著性差异。由表2可知，在不同产区烟叶的 66项具有显著性差异的致香成分中，武陵山区样品中糠醛和吡啶含量在4个产区中最高，4-吡啶甲醛、1H-吡咯-2-甲醛、2,6-壬二烯醛、糠酸和寸拜醇含量最低；渝中渝西地区样品中芳樟醇、3-氧代-α-紫罗兰醇、植醇、苯酚、2-甲基苯酚、4-甲基苯酚、2-甲氧基-苯酚、苯并[b]噻酚、2-吡啶甲醛、苯甲醛、4-吡啶甲醛、1H-吡咯-2-甲醛、壬醛、2,6-壬二烯醛、藏花醛、十四醛、1-(3-吡啶基)-乙酮、氧化异佛尔酮、胡薄荷酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮A、B、C、D、2,3,6-三甲基-1,4-萘二酮、金合欢基丙酮A、吲哚、3-(1-甲基乙基)(1H)吡唑[3,4-b]吡嗪、2,3′-联吡啶、蒽、二氢猕猴桃内酯、肉豆蔻酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸甲酯和亚麻酸甲酯含量均显著高于其他产区；三峡库区样品中棕榈酸含量显著高于其他产区，而2-甲氧基-4-乙烯基苯酚含量显著低于其他产区；渝东北秦巴山区样品中3-甲基-1-丁醇和3-甲基-2-丁烯醛含量显著高于其他产区，而2-环戊烯-1,4-二酮、苯甲醛和金合欢基丙酮A含量最低。

由表2还可知，一些致香成分的标准偏差较大，说明这些化学成分含量在相同产区不同生产点内差异也较大。在同一产区内不同生产点中，对66项致香成分含量差异性分析结果表明，西柏三烯二醇、棕榈酸、茄酮和亚麻酸甲酯含量在武陵山区不同生产点内有明显差异；寸拜醇、西柏三烯二醇、棕榈酸、茄酮、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、金合欢基丙酮A、亚麻酸甲酯含量在渝中渝西地区不同生产点内差异明显；村拜醇、西柏三烯二醇、棕榈酸、茄酮、亚麻酸甲酯含量在三峡库区不同生产点内有明显差异；西柏三烯二醇、茄酮、亚麻酸甲酯、村拜醇、棕榈酸、苯甲醇、β-大马酮、巨豆三烯酮D和巨豆三烯酮B在渝东北秦巴山区不同生产点内有明显差异。此结果说明，重庆不同产区有效致香成分溯源指标与样品的地域来源、溯源范围密切相关，主要受环境因素的影响，这为化学成分指标对产地溯源性研究奠定了基础。

表2 重庆主要烟草种植区烤烟中的致香成分含量 Table 2 Aroma components in flue-cured tobacco samples from main tobacco planting areas in Chongqing μg/g

续表2 Continued table 2

注：表格中的数值用“平均值±标准差”表示，同行数据后标不同小写字母表示同一指标在不同产区间有显著性差异(P<0.05)。

Note:Data in this table are “means±SD”.Different letters in each row mean significant difference between different regions (P<0.05).

2.2 烤烟中致香成分含量的主成分分析及特征指标筛选

对重庆不同产区烤烟中具有显著性差异的66项致香成分指标采用SIMCA-P+11.5软件进行PCA和PLS-DA分析，结果见图1-A和表3。由表3可知，对66项烟叶致香成分原始数据进行PCA和PLS-DA分析，前15个主成分累计方差贡献率为80.73%(提取>1%的主成分数)；采用66项烟叶致香成分含量对重庆烟叶进行分类分析，其中前3个主成分累计方差贡献率为54.07%，主成分提取率较低；武陵山区和渝东北秦巴山区的烟叶样品分类效果不尽理想(图1-A)。上述结果表明采用66项指标对重庆烟叶产地溯源性分析有效性较差。为进一步优化所检测的致香成分指标，采用VIP法，从上述66项指标中筛选出VIP值>1的指标作进一步分析，结果见表4。由表4可知，在筛选出的VIP值>1的33项指标中，糠酸对不同产区的分类贡献较大，丁内酯对不同产区的分类贡献较小，其VIP值分别为1.366和1.003。采用PCA和PLS-DA法对筛选出的33项指标进行分析，结果见图1-B和表3。由表3可知，前10个主成分累计方差贡献率为81.18%(提取>1%的主成分数)。用33项致香成分对重庆不同产烟区进行分类分析，其中前3个主成分累计方差贡献率可达58.71%，主成分提取率有所提高；武陵山区和渝东北秦巴山区的烟叶样品分类效果有所提升(图1-B)。上述结果表明，采用33项指标对重庆不同产烟区产地溯源性分析的有效性较66项指标有所提高。

图1 重庆主要烟草种植区烤烟不同致香成分指标的主成分得分A.66项指标主成分得分图；B.VIP法筛选出的33项指标主成分得分图；t[1]、t[2]、t[3]分别代表第1、第2、第3主成分得分Fig.1 Principal component scores of different aroma components in tobacco from main tobacco planting areas in ChongqingA is the PCA score of 66 parameters;B is the PCA score of 33 parameters selected by VIP；The axis of t[1],t[2] and t[3] mean the first,second and third principal component scores

表3 重庆主要烟草种植区烤烟不同致香成分指标的主成分分析方差贡献率Table 3 Cumulative contribution of variance of principal components of different aroma components in tobacco from main tobacco planting areas in Chongqing %

表4 筛选出的重庆主要烟草种植区VIP值>1烟叶致香成分 Table 4 Aroma components of VIP value greater than 1 had been selected in tobacco from main tobacco planting areas in Chongqing

续表4 Continued table 4

2.3 烤烟中致香成分含量的判别分析

从重庆不同产区烤烟样品各致香成分指标的方差分析、主成分分析和偏最小二乘-判别分析结果可以看出，利用致香成分含量对烤烟产地进行判别分析是可行的。为进一步探索各致香成分指标对烤烟产地判别分析的可行性，采用SPSS 19.0软件对筛选的33项致香成分进行分析，进一步筛选出对烤烟产地判别有效的变量，剔除不必要的干扰变量，建立判别模型。结果显示，苯乙醇(X1)、3-甲基-2-丁烯醛(X2)、2-吡啶甲醛(X3)、4-吡啶甲醛(X4)、糠酸(X5)、3-羟基-2-丁酮(X6)、面包酮(X7)、1-(3-吡啶基)-乙酮(X8)、胡薄荷酮(X9)、β-紫罗兰酮(X10)和亚麻酸甲酯(X11)11项指标先后被引入到判别模型中，建立的判别模型如下。

武陵山区：Y1=-29.819-2.336X1+70.984X2-114.158X3+92.523X4-60.974X5-32.644X6+152.141X7-73.381X8+182.325X9+39.336X10+0.949X11;

(4)

渝中渝西地区：Y2=-98.604-11.958X1-18.118X2-122.566X3+103X4-106.025X5-223.956X6+167.626X7+193.682X8+393.971X9+86.166X10+2.092X11;

(5)

三峡库区：Y3=-40.128-6.034X1-18.662X2-5.349X3+123.859X4+23.99X5-117.427X6+107.066X7-97.195X8+185.19X9+61.683X10+0.855X11;

(6)

渝东北秦巴山区：Y4=-39.323-5.808X1+75.71X2-155.533X3+136.816X4-15.095X5-53.253X6+172.639X7-134.504X8+228.732X9+46.029X10+0.845X11。

(7)

利用以上判别模型对样品进行归类分析，并结合“留一法”[22]对样品进行回代检验和交叉检验分析，结果显示，回代检验判别正确率为92.5%，交叉检验判别正确率为90.5%(表5)。

表5 重庆不同烤烟种植区烟叶致香成分的判别分析结果Table 5 Discriminant analysis of flue-cured tobacco samples from different regions in Chongqing

由表3可知，采用上述11项致香成分对不同产区烟叶进行判别分析，前5个主成分累计贡献率为83.91%，说明主成分提取较为完全。由图2可知，重庆主要烟草种植区的烤烟样品位于不同的空间，表明采用最终筛选出的11项致香成分指标对烤烟产地的判别分析效果较好，是适用于烤烟产地溯源的一种有效方法。

3 讨论与结论

香气物质是影响烟叶质量和可用性的重要因素，烟叶品质的优劣，很大程度上取决于烟叶中的致香成分[23]。遗传和环境因素是决定烟叶品质优劣的主要因素，遗传因素影响香气物质的性质和种类，环境因素则影响香气物质的含量和组分比例[24]。本研究通过对重庆主要烟草种植区(渝中渝西地区、三峡库区、渝东北秦巴山区和武陵山区)12个产地的4个品种(云烟87、云烟97、K326和贵烟四号)烟叶样品致香成分含量进行分析，结果显示，从不同产地、不同品种和不同等级烟叶样品中均检测出70项致香成分，其中除2,4-庚二烯醛B、1-(2-呋喃基)-乙酮、金合欢基丙酮B和新植二烯4项指标在不同产区间无显著性差异外，其余66项指标均具有显著性差异。本研究发现，重庆主要烟草种植区的烟叶样品中致香成分种类基本相同，但含量和比例却不尽相同，这与汪耀富等[4]和刘培玉等[8]的研究结果一致。

图2 重庆主要烟草种植区烤烟不同致香成分指标判别函数的得分t[1]、t[2]、t[3]分别代表第1、第2、第3主成分得分Fig.2 Score of discrimination function of different aroma components in tobacco from main tobacco planting areas in Chongqing The axis of t[1]，t[2] and t[3] mean the first,second and third principal component scores

本研究采用多重分析方法对重庆主要烟草种植区具有显著性差异的66种致香成分含量进行分析发现，在武陵山区样品中糠醛和吡啶含量最高；渝中渝西地区中芳樟醇、3-氧代-α-紫罗兰醇、植醇、β-大马酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮A、B、C、D、金合欢基丙酮A、吲哚、二氢猕猴桃内酯、肉豆蔻酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸甲酯和亚麻酸甲酯等含量显著高于其他产区；三峡库区中苯甲醛和棕榈酸含量显著高于其他产区；渝东北秦巴山区中3-甲基-1-丁醇和3-甲基-2-丁烯醛含量最高。可知不同烤烟种植区烟叶中致香成分含量具有显著性差异，这对采用致香成分物质判别不同烤烟产地烟叶风格特征提供了依据，同时也为后续采用PLS-DA和逐步判别分析证实其产地的可行性奠定了基础。

本研究利用VIP法对66种具有显著性差异的致香成分含量进行分类分析，优化出33种指标，之后并进一步采用逐步判别又从中筛选出苯乙醇、3-甲基-2-丁烯醛、2-吡啶甲醛、4-吡啶甲醛、糠酸、3-羟基-2-丁酮、面包酮、1-(3-吡啶基)-乙酮、胡薄荷酮、β-紫罗兰酮和亚麻酸甲酯11项指标。采用上述11项指标对重庆不同产地烟草进行判别，并对样本分布进行回代检验和交叉检验，正确率分别为 92.5% 和90.5%，表明采用致香成分对烤烟产地的判别效果较好。

烟叶风格特色是烟叶质量中的核心部分，具有确定性、稳定性和可用性特征，受遗传因素、生态环境和栽培技术等多种因素的影响[25-27]。大量研究表明，生态条件对烟叶致香物质含量有显著影响，是烤烟香气风格形成的主导因素，对烟叶吃香味具有明显的、不可代替的地域特征[11,28-31]。对致香成分物质的研究为烟叶风格特色的科学表述奠定了基础，对烟叶风格特色的定位具有重要作用[32-34]。然而，不同地区烟叶致香物质组成基本相同，但其含量差异明显，这是形成不同产地烟叶独特风格的重要因素[4,8]。因此，本研究构建了采用致香成分溯源产地的分类模型，可准确、快速地鉴别和评价不同产地的烟叶，为烟叶产地溯源提供了一种新的方法，该方法为不同产区烟叶风格特色形成的物质基础研究提供了理论依据。

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Aroma components based traceability characteristics of main tobacco planting areas in Chongqing

LIU Jian-li1,CHEN Tao1,ZHU Xiao-wei1,WANG Qian2, YANG Shi-hua3,YUAN Tian-jun3,HOU Ying3

(1ChongqingCorporation,ChinaNationalTobaccoCorporation,Chongqing400023,China；2ChongqingTobaccoQualitySupervision&InspectionStation,Chongqing400023,China；3YunnanCOMTESTORCo.Ltd.,Kunming，Yunnan650106,China)

【Objective】 The contents of multiple aroma components in tobacco were used as original data to study the feasibility of understanding traceability of Chongqing tobacco origin by multivariate statistical analysis method and screen out valid indicators for discriminating tobacco origins.【Method】 Gas chromatography-mass spectrum (GC-MS) apparatus was applied to detect contents of 70 aroma components in 147 flue-cured tobacco samples of 4 varieties (Yunnan tobacco 87,Yunnan tobacco 97,K326 and Guizhou tobacco No.4) from main tobacco planting areas in Chongqing (Wuling Mountain Area of Southeast,Middle and West of Chongqing Region,Three Gorges Reservior Region,Qinling-Daba Region of Northeast).Then,the data were analyzed by different methods including variance analysis,principal component analysis (PCA),partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) and stepwise regression discriminant analysis to select valid indicators for discriminating tobacco origin.A discrimination model was built and its accuracy was verified.【Result】 The contents of aroma components in tobacco samples from different areas of Chongqing were different.Eleven indicators including phenethyl alcohol,3-methyl-2-butenal,2-pyridylaldehyde,4-pyridylaldehyde,furoic acid,3-hydroxide-2-butanone,2-methyl-tetrahydrofuran-3-ketone,1-(3-pyridine)-ketol,pulegone,β-ionone and methyl linolenate were screened from 70 aroma components as indicators for effective discriminating tobacco origins by variance analysis,PLS-DA combined with variance importance in the project (VIP),and stepwise regression discriminant analysis.The return test discrimination accuracy and cross check distinguishing accuracy of established discrimination model using these indicators were 92.5% and 90.5%,respectively.【Conclusion】 The contents of aroma components in combination with multivariate statistical analysis method could be used to discriminate tobacco origins.

tobacco;aroma components;Chongqing;traceability characteristics;GC-MS

2014-01-27

中国烟草总公司重庆市公司科技项目(NY20120802070020)

刘建利(1969-)，男，河北栾城人，研究员，博士，主要从事现代烟草农业、烟叶种植研究。 E-mail：liujl@tobacco.gov.cn

侯 英(1973-)，女，云南蒙自人，高级工程师，硕士，主要从事烟草及烟气成分的分析研究。 E-mail：houying@reascend.com

时间:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.002

S572；TS41

A

1671-9387(2015)08-0093-10

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.002.html