新疆设施蔬菜根结线虫病发生调查及病原鉴定

李克梅, 董艳秋, 曹雪松, 巴依尔

(新疆农业大学农学院,乌鲁木齐 830052)

新疆设施蔬菜根结线虫病发生调查及病原鉴定

李克梅#*, 董艳秋#, 曹雪松, 巴依尔

(新疆农业大学农学院,乌鲁木齐 830052)

对新疆蔬菜根结线虫病的发生情况进行了调查,发现蔬菜根结线虫在和田、阿克苏、库尔勒、吐鲁番、伊犁等南北疆设施蔬菜上均有分布和发生危害,露地蔬菜尚未见发生。从各发生地温室中采集14份蔬菜根结线虫样本,寄主主要是番茄,另外还有豇豆、黄瓜、生菜、香芹、苦瓜。采用形态学以及根结线虫特异性引物PCR相结合的方法进行鉴定,结果表明新疆设施蔬菜上有南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和北方根结线虫(M.hapla)两种,优势种群为南方根结线虫。

根结线虫; 形态学观察; 分子鉴定

根结线虫(Meloidogyne spp.)是世界上危害最严重的植物病原线虫之一,也是一类在蔬菜作物上危害极大的线虫,其寄主范围广泛,种类多,分布广,几乎能侵染所有蔬菜作物[1]。新疆地处中国西北边陲,由于冬季气候寒冷,并不适于根结线虫的生存越冬。但是随着新疆设施农业的迅猛发展及农业种植结构的调整,设施栽培的高复种指数和长期单一化的栽培为蔬菜根结线虫的发生、发展提供了适宜的生长环境,土壤中的根结线虫得以积聚增殖[2]。蔬菜根结线虫逐渐成为当前新疆设施蔬菜生产中的一大障碍。1991年全俊仁等[3]在新疆农业科学院园艺研究所首次发现辣椒根结线虫,经鉴定为北方根结线虫(Meloidogyne hapla)。2009年杜兰英等[4]在新疆哈密发现黄瓜根结线虫病的发生。据调查目前根结线虫病已经在新疆多地设施蔬菜发生严重,特别是在阿克苏、吐鲁番、伊犁、轮台、库尔勒等南北疆设施蔬菜发生危害严重。但是对其病原种类及其分布尚不明确。目前关于该病害的防治主要采取化学手段,而使用化学药剂对蔬菜生产安全造成极大隐患,更会对人体和环境造成危害[5],因此根结线虫病的绿色防治迫在眉睫。

鉴于不同种根结线虫之间有显著的致病性差异[6],因而准确鉴定根结线虫的种类是防治根结线虫病的基础。本研究运用形态学描述以及分子生物学技术鉴定了新疆不同地区设施蔬菜根结线虫的种类,为进一步开展新疆设施蔬菜根结线虫病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2013年9月-2014年5月从新疆7个不同县、市设施蔬菜大棚中采集14份蔬菜病株及病土材料(见表2),带回实验室置于4℃冰箱备用;从每份病根样品中挑取20个单卵囊分别接种于预先培植在灭菌沙培马铃薯根部,置人工气候箱25℃培养,建立纯化种群。

1.2 试剂和仪器

试验所用试剂、酶类等均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 形态学鉴定

形态学鉴定标准参照刘维志[1]的方法。将收集到的2龄幼虫、雄虫热杀死后用FG固定液固定,制备临时玻片镜检观察,描述形态。雌虫会阴花纹玻片的制作参照冯志新等[7]的方法,镜检观察会阴花纹特征并照相。

1.4 根结线虫的DNA提取

参照王江岭等、沈锡权等[8-9]提取单条根结线虫DNA的方法并稍作改进。大量根结线虫DNA的提取参照孙龙华等[10]所介绍的方法并稍作修改。

1.5 特异性引物PCR鉴定方法

选用Meng等[11]报道的根结线虫特异性扩增引物MI-F/MI-R、MJ-F/MJ-R,冯光泉等[12]报道的Mh-F/Mh-R分别进行特异性扩增(引物序列见表1)。采用25μL反应体系：2μL 10×PCR Buffer (Mg2+);2μL d NTPs(2.5 mmol/L);引物各0.5μL (10μmol/L);0.2μL(5U)Taq酶;DNA悬浮液2μL, dd H2O补足至25μL。扩增条件为：94℃5 min,94℃30 s,退火温度(61℃或55℃)45 s,72℃2 min,30个循环,72℃8 min,4℃保存。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外照胶仪上观察并照相。

表1 根结线虫分子鉴定所用引物Table 1 PCR primers used for molecular identification of root knot nematodes

2 结果与分析

2.1 发病症状

感染根结线虫病轻病株症状不明显,重病株生长不良,植株矮小,结实小且少,严重时整株叶片黄化甚至萎蔫枯死。根部产生多个根结,有时膨大成团状。卵囊初期呈黄白色,后呈黄褐色至黑褐色。解剖根结可见其中有针尖大小的乳白色近透明的梨形雌虫。

2.2 病原根结线虫形态鉴定

对采自新疆各地的根结线虫进行形态观察发现有2个不同类群。

类型1：

2龄幼虫：头冠清楚,有不太明显的环纹,口针较细,椎体与基杆的界限明显,口针基部球小且向后渐圆,中食道球椭圆形,瓣门明显,大多数直肠膨大,尾透明,末端界限大多明显,通常不平滑,稍有缢缩,尾尖钝圆或尖圆。

雄虫：体比较长,头冠明显凹陷,头区有不完全环纹,但是不明显。口针锥顶端钝,口针基部球横向扩展,与基杆界限分明,尾端细圆。

类型2：

2龄幼虫：头冠窄小,头区无环纹,口针细小,基部球圆,多数直肠不膨大。尾端较粗,尾透明末端界限明显。

雄虫：体比较短小,有的小于1 000μm,头冠比头区小,头部与体部界限分明。口针椎体部窄,向后渐粗,口针基部球圆形,与基杆分界分明,尾端钝圆。

参考刘维志主编的《植物病原线虫学》[1]、《植物线虫志》[13],认为类型1与南方根结线虫相类似,类型2与北方根结线虫相似。

对采自新疆7个地区的14个根结线虫样本会阴花纹进行观察,主要发现2种会阴花纹表型(图1)。一种主要特征是：整体卵圆形,线纹平滑或有时呈“Z”形,背弓较高,呈方形,侧线交叉成刻痕,有些不明显。另一种会阴花纹主要特征为：背弓通常呈圆形,线纹较平滑,侧线不明显,尾端处有明显刻点。分别与刘维志[1]描述的南方根结线虫(M.incognita)和北方根结线虫(M.hapla)会阴花纹相似。

2.3 分子生物学鉴定

分别对采自新疆不同地区温室中寄主为番茄样品的根结线虫混合群体进行特异性引物PCR检测,其中以MJ-F/MJ-R为引物未扩增出任何特异性条带,而引物MI-F/MI-R和引物Mh-F/Mh-R则在不同样品中均得到与预期大小相同的片段,说明新疆设施蔬菜上存在M.incognita和M.hapla 2种根结线虫(图2)。

图1 两种根结线虫雌虫会阴花纹形态图Fig.1 Morphology of two kinds of root knot nematode female perineal pattern

图2 新疆不同地区部分番茄土样中采集的根结线虫经特异性引物扩增的电泳图谱Fig.2 PCR amplification with root-knot nematode DNA from tomato soil sampled in different areas of Xinjiang by specific primers

分别对新疆14个样品中单卵囊接种培育的根结线虫DNA进行特异性引物PCR检测,以伊犁地区样品为例(图3),用单卵囊接种培育的20个纯种群分别提取总DNA,经过特异性引物检测后计算出2个种的比例。

图3 新疆XJ-4种群纯化根结线虫DNA经特异性引物扩增的电泳图谱Fig.3 PCR amplification with root-knot nematode DNA of XJ-4 by specific primers

特异性引物MI-F/MI-R扩增片段约为950 bp左右,与南方根结线虫大小一致,特异性引物Mh-F/Mh-R对供试线虫PCR扩增片段约460 bp,与北方根结线虫大小一致。由图3可知伊犁地区设施蔬菜根结线虫群体中有南方根结线虫和北方根结线虫,比例为17∶3。

根据对根结线虫的形态和会阴花纹的观察,结合特异性引物检测,结果表明新疆有南方根结线虫和北方根结线虫2个种。其中14份样品中有9份样品是包含南方和北方根结线虫2个种的混合种群,南方根结线虫为优势种群,另外5份样品仅包含南方根结线虫1个种(表2)。

表2 不同来源设施蔬菜根结线虫样本鉴定结果Table 2 Identification of greenhouse vegetable root knot nematodes from different samples

3 结论与讨论

世界上已报道的根结线虫种类有90多种,中国已报道的有56种[14],其中南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫和北方根结线虫是地理分布和寄主范围最广、最常见的种类[15],在37°N以北地区最常见是北方根结线虫[16]。据报道,由根结线虫引起的农作物损失中90%以上由上述4个最常见种引起[6]。我国王仁刚等[17]报道的北京市蔬菜病原根结线虫为南方根结线虫,柳永娥等[18]报道的甘肃省白银市蔬菜病原根结线虫为南方根结线虫和爪哇根结线虫,其中南方根结线虫为优势种群。本研究通过线虫形态学结合根结线虫不同种的特异性引物扩增片段鉴定出新疆不同地区的14个样品中既有南方根结线虫也有北方根结线虫,根据对本研究每个群体提取20份单卵囊纯化培养后的大量2龄幼虫DNA的PCR检测结果可知其中优势种群是南方根结线虫。

近年来,关于鉴定根结线虫种类的研究报道有很多,目前最稳定的还是分子生物学鉴定方法。本研究开始采用线虫ITS通用引物进行PCR,并不能完全快速鉴定根结线虫种类,因为种与种之间ITS区差异很小,它只是重要病原线虫种间水平的强有力的辅助工具,必须结合形态学或其他分子生物学方法才能准确地进行根结线虫的分类[16]。于是本试验进行特异性引物PCR,可以依据扩增片段长度多态性来鉴定根结线虫。这种方法能够快速、准确地鉴定出根结线虫的种类,并且不受虫体发育以及周围环境的影响,而且对于雄虫和单条2龄幼虫也同样适用。本试验结果也为新疆根结线虫种群的综合防治提供了重要的依据和基础。

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(责任编辑：王 音)

Occurrence and identification of root-knot nematode on greenhouse vegetables in Xinjiang

Li Kemei, Dong Yanqiu, Cao Xuesong, Bayier

(College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

Occurrence of vegetables root-knot nematode diseases was investigated in Xinjiang.Root-knot nematodes occurred in greenhouse vegetables in Hotan,Aksu,Korla,Turpan,Ili prefecture in South and North of Xinjiang,but didn’t find in open field vegetables.Fourteen samples of root-knot nematode were collected in the greenhouse in seven counties and cities of Xinjiang.We found that host plants are mainly tomato,cowpea,cucumber,lettuce,celery,and bitter melon.Morphology observation and PCR amplification results indicated that of the sampled knot-root nematodes belong to Meloidogyne incognita and M.hapla,respectively,and the dominant population was M.incognita.

Meloidogyne spp.; morphological observation; molecular identification

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.035

2014-10-02

2015-02-25

新疆维吾尔自治区教育厅重点项目(XJEDU2012I17);溢达奖学金

*通信作者 E-mail：835004213@qq.com

# 并列第一作者,对本文具同等贡献。