杨树烂皮病内生拮抗菌的筛选及鉴定

陈越渠, 李立梅, 毛 赫, 张立民, 王牧原, 李殿锋, 张晓军*

(1.吉林省林业科学研究院,长春 130033;2.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,北京 100091; 3.吉林省林业调查规划院,长春 130022;4.吉林省双辽市林业局森防站,吉林 136400)

杨树烂皮病内生拮抗菌的筛选及鉴定

陈越渠1,2, 李立梅1, 毛 赫1, 张立民1, 王牧原3, 李殿锋4, 张晓军1*

(1.吉林省林业科学研究院,长春 130033;2.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,北京 100091; 3.吉林省林业调查规划院,长春 130022;4.吉林省双辽市林业局森防站,吉林 136400)

从健康杨树枝条上分离到1株能有效抑制杨树烂皮病菌的内生细菌,编号为NS3。该菌株对供试的13种植物病原菌均有抑制作用,抑菌谱广,其中对杨树烂皮病和杨树溃疡病病原菌抑制作用最强,其活菌的平均抑菌带宽度达到25.6 mm以上,发酵液的抑菌圈直径达到48.6 mm以上;人工接种防治试验结果表明：发酵液的无菌滤液对杨树烂皮病具有良好的生防作用,保护作用和治疗作用分别达85.4%和69.6%,与生产上用于防治该病的常用药剂防治效果差异不显著;根据其菌株形态、生理生化特征和16S rDNA序列比对,最终将该菌株鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。

枯草芽胞杆菌; 分类鉴定; 生防作用

植物内生菌(endophyte)是指其生活史的一定阶段或全部阶段生活于植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内,并且对植株不(或暂时不)造成可见危害的细菌[1]。植物内生细菌分布于植物的不同组织中,依靠植物提供充足的营养物质,同时因受到植物组织的保护,不受外部恶劣环境的影响,具有稳定的生态环境。因此,内生细菌相对于附生细菌更易于发挥生防作用,其防病机理主要表现在通过产生抗生素类、水解酶类、植物生长调节剂和生物碱类物质,或与病原菌竞争营养物质或空间,增强宿主植物的抵抗力以及诱导植物产生系统抗性等途径抑制病原菌生长[2]。植物内生细菌是植物病害防治的潜在资源菌,国内外已有很多报道[3-12]。关于从杨树枝条中筛选杨树烂皮病菌土著拮抗细菌的研究,国内仅见任嘉红等的报道[12]。本研究从45株杨树内生细菌中,筛选获得了1株能够有效防治杨树烂皮病的拮抗菌株,编号为NS3。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 杨树样品

从吉林省双辽地区采集杨树枝条若干份进行内生细菌的分离。

1.1.2 供试植物病原菌

杨树烂皮病菌(Vasal sordida)和杨树溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)由本研究室分离保存。苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternata f.sp.mali)、甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. melonis)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、大豆炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)由沈阳农业大学植物病毒研究室馈赠。

1.1.3 供试培养基

细菌分离纯化采用营养琼脂(NA)培养基,菌株筛选及抑菌谱测定选用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

菌种发酵用液体培养基：牛肉膏3.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母膏1.0 g,葡萄糖10.0 g,蒸馏水1 000 mL, p H 7.0～7.2。

1.1.4 16S r DNA序列分析试剂

树脂型TM基因组DNA提取试剂盒购自赛百盛; 16S r DNA forward primer/reverse primer 2、16S r DNA Bacterial Identification PCR Kit和Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0购自TaKaRa。阳性对照为已测定菌株的16S r DNA PCR产物。

1.2 方法

1.2.1 杨树内生菌的分离

分离方法参照《植物研究方法》[13],采用逐级平板稀释涂布分离,每天观察并挑选菌落形态不同的菌株转接到NA斜面上培养,并编号保存。采用组织印迹法检验杨树组织表面消毒的效果：取最后1次无菌水冲洗液100μL涂于NA培养基上,3次重复,培养3 d后,若培养皿中无菌落生长,则表示材料表面消毒彻底,否则,该分离结果不能使用。

1.2.2 杨树内生菌室内抑菌活性测定

以杨树烂皮病菌为靶标菌,通过对峙培养,测定1.2.1分离得到的内生菌的抑菌活性。将杨树烂皮病菌制成直径7 mm的菌饼,放置在培养皿中央,用接种环挑取培养72 h的内生菌,在距离菌饼上下2.5 cm处平行画线,28℃恒温培养72 h后测量内生细菌与病原真菌之间抑菌带宽度。选择拮抗活性强的菌株发酵,进行抑菌谱的测定。

1.2.3 菌株发酵液制备

在装样量为500 m L的三角瓶内装发酵培养液200 m L,根据1.2.2的结果,选择抑菌活性强的菌株NS3转接至发酵培养液中,28℃,150 r/min恒温振荡培养4 d,得到的发酵液经8 000 r/min离心15 min,取上清液用细菌过滤器去除菌体,备用。

1.2.4 发酵液抑菌谱测定

采用杯碟法,将活化的各病原菌制成孢子悬浮液(10×15倍下,30～40个/视野),吸取300μL加入70 m L融熔态PDA培养基中,制成混菌平板,培养皿中央放置牛津杯,加入菌株发酵液100μL, 28℃恒温培养72 h后十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.5 菌株发酵液对杨树烂皮病的防治效果

1.2.5.1 杨树烂皮病菌的接种

选择1年生杨树扦插苗用于接种。将杨树烂皮病菌接种于PDA培养基,26℃恒温培养5～7 d,用d=7 mm打孔器打成菌饼备用。用刀片将杨树干部划伤,将杨树烂皮病菌菌饼贴在伤口处,用脱脂棉蘸杨树叶片汁液保湿,每处理15株,3次重复,保湿7 d后去除菌饼。

1.2.5.2 菌株发酵液对杨树烂皮病的保护和治疗作用

分别于接种前5、10、15 d和去掉菌饼后5、10、15 d,将NS3发酵上清液5倍稀释液、50%退菌特(25%福美双、12.5%福美锌、12.5%福美甲胂)可湿性粉剂、40%福美胂可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(3种农药均为河北冠龙农化有限公司生产)及清水对照均匀涂抹于杨树干部,于最后一次施药后7 d观察苗木发病情况,计算防治效果。

病情指数分级标准,参考吉林省地方标准[14]：

Ⅰ级(代表值0)—无病;

Ⅱ级(代表值1)—病斑横向长度占树干周长的1/4以下;

Ⅲ级(代表值2)—病斑横向长度占树干周长的1/4～2/4以下;

Ⅳ级(代表值3)—病斑横向长度占树干周长的2/4～3/4以下;

V级(代表值4)—病斑横向长度占树干周长的3/4及以上～树木濒死或者死亡。

1.2.6 菌株鉴定

1.2.6.1 菌株形态观察

菌株形态特征、培养性状、生理生化指标根据《伯杰细菌鉴定手册》[15]。利用扫描电镜观察杨树内生细菌的形态,处理方法参考杨瑞等的方法[16]。

1.2.6.2 菌株总DNA提取

将纯化的NS3菌株保存在试管斜面中,培养24 h后,挑取菌株,利用树脂型TM基因组DNA提取试剂盒提取菌株总DNA。

1.2.6.3 16S r DNA序列分析

PCR反应条件：94℃变性5 min;94℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸2 min,35次循环; 72℃延伸5 min,4℃保存,其他按照各试剂盒的操作流程操作,将回收产物送至大连宝生物公司测序。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛

经过2次平板稀释纯化后,挑取单菌落,获得了形态、大小、颜色一致的纯化菌株45株,将这些菌株在NA斜面上培养,4℃保存,作为原始菌株备用。

所得的45株菌株中有6株对杨树烂皮病病菌的抑制效果较好,其抑菌带宽度大于15 mm(表1),其中,菌株NS3抑菌效果最好,抑菌带宽度达28.3 mm,因此选定NS3为下一步试验的菌株,进行深入研究。

表1 内生菌活体对杨树烂皮病菌的抑菌活性1)Table 1 Inhibition activity of antagonistic bacteria to Vasal sordida

2.2 内生菌NS3及其发酵液的抑菌谱

平板对峙试验结果显示：内生菌NS3对所有供试菌株均有一定的抑制作用(表2)。其中对杨树烂皮病菌、杨树溃疡病菌和水稻恶苗病菌的抑制作用最强,可见清晰的抑菌带,抑菌带平均宽度达到25 mm以上,对大豆炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、烟草靶斑病菌和水稻纹枯病菌具有较强的抑制作用,抑菌带宽均在20 mm左右,而对其他6种供试病原菌,抑菌带宽亦达10 mm以上。

表2 内生菌NS3活体和发酵液的抑菌谱Table 2 Antimicrobial spectrum of antagonistic microorganism and fermented broth of NS3

发酵液抑菌活性测定结果表明：菌株NS3的发酵液对杨树溃疡病菌和杨树烂皮病菌有明显的抑制作用,尤其是对杨树烂皮病菌,抑菌圈直径达50.5 mm,对杨树溃疡病菌的抑菌圈直径亦达到48.6 mm(表2),与其他供试病原菌差异显著,且其发酵液仍保持了较广的抑菌谱,即内生菌NS3无论活体菌还是发酵液,其抑菌谱均较广,有进一步研究的价值。

2.3 NS3发酵液对杨树烂皮病的防治效果

不同方式处理的苗木发病率和病情指数见表3,对照苗木发病率和病情指数分别为82.2%和49.4;接种前采用NS3处理的苗木发病率为20%,病情指数为7.23,接种后涂药处理的发病率和病情指数分别为42.2%和15,保护作用和治疗作用分别为85.4%和69.6%;40%福美胂可湿性粉剂和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂处理的保护作用均为89.8%,治疗作用分别为74.4%和79.3%。随着调查时间的延长,发现清水对照处理的苗木在之后的几周内病斑逐渐扩大,在病斑处可见明显的分生孢子器,个别出现分生孢子角;各处理感病的植株病斑几乎没有继续扩大,病斑处未见分生孢子器。上述结果表明,NS3发酵液对杨树烂皮病菌有显著的抑制作用,即使杨树已感染杨树烂皮病菌,也有较好的治疗效果。保护作用和治疗作用均略低于所供试的3种药剂,但均差异不显著。

表3 NS3发酵液对杨树烂皮病的防治效果Table 3 Control effects of fermented broth against Vasal sordida

图1 菌株NS3芽胞形态Fig.1 The spores of strain NS3

2.4 菌株NS3的分类地位

2.4.1 菌株NS3的形态特征

菌株NS3经革兰氏染色确定为革兰氏阳性菌。在NA培养基上生长良好,培养24 h后菌落为圆形或近圆形,乳白色,不透明,表面不光滑,不产色素,随着培养时间延长,菌落变干,边缘突起,菌落上有褶皱及突起,亚甲基兰染色后光学显微镜下可见菌体呈杆状,电镜下观察,芽胞椭圆形至柱状(0.6～0.9)μm×(1.0～1.5)μm(图1)。

2.4.2 菌株NS3的生理生化特性

对菌株NS3各种生理生化反应进行测定,部分结果见表4。碳源利用测定表明,该菌株可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、果糖,不能利用木糖;耐盐性测定表明,该菌株在7%NaCl培养基中,仍然可以生长,根据《伯杰细菌鉴定手册》,初步判定菌株NS3为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。

2.4.3 菌株NS3的16S rDNA鉴定

取DNA 1μL,进行3%琼脂糖凝胶电泳,结果(图2a)表明,所提的DNA完整性很好,无污染,可用于下一步试验。菌株NS3的16S r DNA基因扩增产物如图2b所示。结果表明,扩增产物的大小约为1.5 kb,扩增效果良好。与报道的枯草芽胞杆菌16S r DNA大小一致。用Agarose Gel DNA Purifi-cation Kit进行目的片段的切胶回收,回收片段的大小约为1.5 kb(图2c),可以用于序列测定。菌株NS3的16S r DNA基因扩增片段全长为1 040 bp (图2b)。与GenBank数据库中相关细菌菌株的16S r DNA序列相比,菌株NS3与已知的细菌Bacillus subtilis strain H1(基因登录号KM084864.1)的16S r DNA同源性最高,达到99%,选择与菌株NS3同源性较高的序列,进行系统发育分析,结果表明菌株NS3与Bacillus subtilis strain H1(KM084864.1)和Bacillussubtilis subsp.subtilis CICC 10076(GQ375227.1)亲缘关系最近,因此初步确定菌株NS3为枯草芽胞杆菌(基因登录号KM667974)。

表4 菌株NS3的生理生化特征1)Table 4 Cultural characteristics of strain NS3

图2 NS3基因组DNA,16S rDNA PCR产物和16S rDNA PCR回收产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis of the genomic DNA and 16S r DNA PCR products of strain NS3

图3 菌株NS3及相关菌株的系统发育分析Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus subtilis strain NS3

3 结论与讨论

杨树烂皮病是一种世界性的寄主主导型病害,严重影响杨树产业的发展,目前对该病的防治尚无理想的方法。

本研究从杨树枝条分离得到土著内生细菌,以杨树烂皮病菌为靶标菌进行筛选,最终选定1株抑菌效果最强的菌株,编号为NS3。该菌株发酵液的无菌滤液,不仅在体外平皿试验中表现出了对杨树烂皮病菌强烈的抑制作用,同时,对人工接种杨树烂皮病菌的杨树苗也表现出了良好的防病效果,具有开发应用前景。

菌株NS3对供试植物病原真菌有较广谱的抗性,对杨树烂皮病、杨树溃疡病的抑制作用最强,活菌对峙培养对上述两种病原菌的平均抑菌带宽度达到25.6 mm以上,杯碟法测定发酵液对上述两种病原菌的抑菌圈直径达到48.6 mm以上,人工接种防治试验表明,其发酵液中的生物活性物质对杨树烂皮病具有显著的防治效果,其保护作用和治疗作用分别达85.4%和69.6%,与生产上用于防治该病的常用药剂防治效果差异不显著,且该发酵液与化学农药相比,低毒、无残留,与环境友好,更符合可持续控制理念。

本研究经生理生化特征、电镜形态观察及16S r DNA序列比对,最终确定NS3为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。这是国内首次以林业病害病原菌为靶标筛选内生拮抗细菌,并将其鉴定到种,对林业病害的生物防治具有重要意义。

如果能很好地利用拮抗菌作为杨树烂皮病生物防治的手段,对恢复和建立生态平衡,以及杨树烂皮病的综合治理具有非常重要的意义。杨树烂皮病的室内生物防治试验及人工接种防治试验的结果,可为今后生物药剂的研制和生产提供理论依据。而该生防菌与其他细菌在杨树体内的消长动态关系、发酵条件、生防剂型的研制等问题还有待今后进一步研究。

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(责任编辑：杨明丽)

Screening of antagonistic bacteria of Valsa sordida and identification of the strain NS3

Chen Yuequ1,2, Li Limei1, Mao He1, Zhang Limin1, Wang Muyuan3, Li Dianfeng4, Zhang Xiaojun1

(1.Jilin Academy of Forestry Sciences,Changchun 130033,China;2.Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China; 3.Jilin Forestry Survey and Planning Institute,Changchun 130022,China;4.Control and Quarantine Station of Forest Pest,Shuangliao Forestry Bureau,Jilin 136400,China)

An antagonistic bacterial strain NS3 against Vasal sordida was isolated from poplar branches.The NS3 strain displayed a broad-spectrum inhibition to all the 13 pathogenic fungi tested in this study.Of them,its inhibitive effect to Vasal sordida and Botryosphaeria dothidea was the strongest,with a width of inhibition zone of more than 25.6 mm and a diameter of 48.6 mm averagely for NS3 fermented broth.Meanwhile,the inoculation test suggested its great potential for biocontrol.The protection and curation of the fermented broth against V.sordida were raised to 85.4%and 69.6%,respectively.On the basis of the morphological and physiological-biochemical characteristics as well as 16S r DNA sequence analysis,the bacterium was identified as Bacillus subtilis.

Bacillus subtilis; taxonomic identification; biocontrol effect

S 763.1,S 718.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.023

2015-03-23

2015-06-16

林业公益性行业科研专项(201204501);吉林省科技发展计划青年基金(201201092);吉林省科技发展计划重点项目(20110267)

*通信作者 E-mail：0431zxj@163.com