烟粉虱取食感染TYLCV番茄对其解毒酶和保护酶活性的影响

曹 增, 王金娜, 张友军, 吴青君, 谢 文, 王少丽

(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

烟粉虱取食感染TYLCV番茄对其解毒酶和保护酶活性的影响

曹 增, 王金娜, 张友军, 吴青君, 谢 文, 王少丽*

(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

为了明确感染番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的番茄对烟粉虱生理防御的影响,本文采用生化分析法研究了烟粉虱取食感染TYLCV的番茄植株后解毒酶和保护酶活性的变化。结果表明,B型烟粉虱在带毒番茄上取食72 h及30 d(长期饲养种群)后,其谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和羧酸酯酶(CarE)活性呈现先升高后下降的趋势,而P450酶活性则持续上升,取食30 d种群是对照种群的1.99倍;三大保护酶系超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)则在取食72 h后,酶活性高于对照,而在感染TYLCV番茄上取食30 d后,保护酶活性则持续高于72 h及对照处理,分别是对照种群的1.45倍、8.42倍和5.03倍,差异显著;Q型烟粉虱表现趋势与B型烟粉虱相似。研究结果为进一步明确入侵烟粉虱与双生病毒之间的互作、揭示烟粉虱的适应性机制等补充了资料。

烟粉虱; 番茄黄化曲叶病毒; 解毒酶; 保护酶

烟粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]属半翅目(Hemiptera),粉虱科(Aleyrodidae),是一种世界性的重大农业害虫,该虫除了以成虫和若虫刺吸植物汁液、分泌蜜露引发煤污病、影响植物光合作用之外,还可传播双生病毒,如番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),常年使农作物减产30%～50%,严重时甚至绝收[1-2]。近年来研究表明,烟粉虱是由形态上不可区分、生物学特性存在显著差异的30余种生物型(biotype)或隐种(cryptic species)组成的复合种害虫[3-4]。在烟粉虱众多生物型或隐种中,B生物型(隐种MEAM1,本文简称B型烟粉虱)和Q生物型(隐种MED,本文简称Q型烟粉虱)入侵性最强、危害最大。

大量研究表明,烟粉虱-寄主植物-双生病毒之间存在着明显的互作[56]。番茄植株感染双生病毒-番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)后会间接影响到烟粉虱的取食选择,不带毒的Q型烟粉虱更喜欢在感染病毒的番茄植株上取食和产卵,而B型烟粉虱则喜欢在健康植株上取食,然而,烟粉虱携带双生病毒后对带毒和健康番茄植株不存在取食选择性,研究发现这与番茄植株感染病毒后其挥发物组分发生变化密切相关[5]。烟粉虱体内的TYLCV会影响其生长发育,携带TYLCV的B型烟粉虱较未携毒的B型烟粉虱在棉花植株上的存活率、产卵量均显著下降,雌成虫和雄成虫的体长明显变短,表现出TYLCV对B型烟粉虱的不利作用;而携带和未携带TYLCV的Q型烟粉虱在棉花上的生物学特性则无显著差异,表现为TYLCV对Q型烟粉虱的生长发育呈中性作用[6];而B型烟粉虱取食感染中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)的烟草寄主时,其繁殖力和寿命可比对照分别增长18倍和7倍[7]。随后发现在带毒烟草寄主上饲养B型烟粉虱时,其产卵量增多,且成熟卵的比例显著高于土著烟粉虱[8],说明双生病毒能够直接调控烟粉虱的生长发育及生殖行为,并通过寄主植物间接影响烟粉虱的种群适合度及其表现[9]。利用刺吸电位技术(electrical penetration graph,EPG)研究同时也证实了病毒能够不同程度地调控B型和Q型烟粉虱的取食及传毒能力,进而影响到病毒的传播和不同种类烟粉虱之间的竞争[10]。而这种植食性昆虫、病毒与寄主植物之间的互作关系可能因各研究系统中植食性昆虫、病毒及寄主植物的种类不同而异[7]。

昆虫在与寄主植物协同进化过程中,形成和构建了自身的防御系统及机制。寄主植物感染毒后,烟粉虱作为媒介昆虫在寄主植物上取食并获得病毒,其最快可在5 min之内获取病毒[1112]。研究证明,烟粉虱在获得植物病毒后其生物学特性、传毒能力等均有不同程度的变化[6,10]。同时,双生病毒对烟粉虱来说是一种异源物质,烟粉虱携带该类病毒后,可能会引起自身的防御反应或者调节反应。解毒酶和保护酶是昆虫体内两类重要酶系,在对抗逆境及维持昆虫正常的生理生化代谢方面具有重要作用,常被用来作为评价昆虫生理适应性的指标[13]。将B型烟粉虱雌成虫分别饲养在健康和感染TYLCCNV的烟草上后,转录组测序及定量PCR研究表明带毒植物上的烟粉虱体内解毒酶基因表达趋于下调,说明烟粉虱可能通过降低解毒酶活性来降低能量消耗,从而提高其在带毒植物上的适合度[14]。不同的是,褐飞虱(Nilaparvata lugens Stål)在取食了感染水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)的水稻后,成虫寿命和繁殖力没有显著变化,但其体内的保护酶和解毒酶系活性均显著升高,促进了褐飞虱在带毒水稻上的适应性[15]。烟粉虱携带双生病毒是否会出现类似的或者不同的生理防御反应尚不明确。为了揭示烟粉虱取食感染双生病毒TYLCV的番茄寄主后可能出现的防御反应,本文拟研究其取食感染TYLCV的番茄后体内解毒酶和保护酶活性的变化,以期为进一步深入理解烟粉虱-病毒之间的互作关系,揭示外来入侵烟粉虱的适应性机制及其综合治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试烟粉虱与寄主植物

B型和Q型烟粉虱经生物型鉴定[16]后分别在室内以番茄(Lycopersicon esculentum)(‘中杂12号’)为寄主建立试验种群,室内连续饲养3代以上。温室内试虫饲养条件为：(28±1)℃,相对湿度60%～80%,光周期L∥D=16 h∥8 h。

健康的无虫苗的获得：在温室的无虫间内播种,随后将长出真叶的番茄苗移栽到直径约15 cm的营养钵内,整个播种及饲养过程,未施用任何化学农药。

带毒番茄植株的获得：室内选取含2～3片真叶、无病无虫、长势一致的番茄植株,将TYLCV分离物DNA-A侵染的重组土壤农杆菌(由中国农业科学院植物保护研究所周雪平教授实验室构建并惠赠)注射于植株韧皮部,接种后的植株置于温室养虫笼中培养。约30 d后,选择具有明显发病症状(叶脉增粗、叶片背面出现耳突、部分叶片呈黄化,卷曲状等)的植株,通过PCR检测[17]确定其携带有TYLCV病毒。

烟粉虱试虫：让B型和Q型烟粉虱分别在健康和带毒番茄寄主植物上取食72 h及30 d(约1代,作为长期带毒虫源)后,选取成虫作为试虫制备酶液。不同饲养期处理和对照均重复3次。

宏观审慎视角下的国际资本管控，应从优化改进经济结构体制的大方向出发，逐步增加国内投资减少对国际资本的依赖性。首先要改变外资机构，调借外商直接投资的产业类型和产业结构。出台相关扶持政策、鼓励政策，引导外商将资本投资于基础产业、支柱型产业以及高新产业，对在西部以及经济发展水平较为落后区域投资的外商应在政策上给与进一步的优惠。从而刺激外商对西部地区进行投资。其次要扩大国内资本的投资范围。进一步鼓励号召民间资本扩大其投资领域和范围，改善我国内部投资市场环境，鼓励和引导民间资本的健康发展。

1.2 试剂与主要仪器

还原型L-谷胱甘肽(GSH)和还原辅酶Ⅱ(NADPH)均为Roche公司产品;乙二胺四乙酸(EDTA)为Amresco公司产品,纯度＞99%;蛋白定量试剂盒购自北京博迈德科技发展有限公司;保护酶活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所; α-萘酚及其他试剂购自北京化工厂。

PCR仪为美国伯乐公司的S1000扩增仪;高速冷冻型离心机购自Sigma公司;测定酶活性采用SpectraMax M2/M2e型酶标仪(Molecular Devices,美国)。

1.3 烟粉虱解毒酶活性测定

1.3.1 羧酸酯酶(Car E)活力测定

羧酸酯酶活性测定参照van Asperen的方法[18],略作修改。取同一时期初羽化的烟粉虱成虫50～60头置于1.5 mL离心管,加入混有1 g/L Triton X-100的PBS缓冲液500μL低温研磨匀浆,随后置于4℃下30 min,所得溶液即为酶源。依次取50μL上述酶源于96孔板孔中,每孔中加200μL 6 g/L的RR固蓝盐和1 mmol/L的α-NA的混合液,30℃下反应15 min,测定其在600 nm处的吸光值。重复3次,取平均值。根据制作的标准曲线和酶源蛋白含量的测定结果,计算Car E的比活力(OD/min/mg pro)。

1.3.2 谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活性测定

1.3.3 多功能氧化酶P450活性测定

参照Yu等[20]和Feng等[21]的方法测定P450的对硝基苯甲醚O-脱甲基活力,并略有改动。取80头初羽化的烟粉虱成虫,液氮速冻后置于玻璃匀浆器中,加入1 m L PBS缓冲液研磨,再转移到新的1.5 m L离心管中,13 000 r/min,4℃下离心10 min,然后取700μL上清液,加300μL PBS缓冲液,作为粗酶源;取2μmol/L对硝基苯甲醚(PNA)375μL、9.6 mmol/L NADPH 37.5μL和粗酶源337.5μL共750μL作为反应体系,34℃水浴30 min,将反应液加入酶标板孔,每孔200μL,在波长405 nm处读数。在多功能氧化酶MFO的作用下,底物对硝基苯甲醚生成对硝基苯酚,以对硝基酚作标准曲线,用对硝基酚的生成量表示酶活力[nmol·(mg pro)-1·(30 min)-1]。

1.4 烟粉虱保护酶活性测定

1.4.1 保护酶酶液的制备

取初羽化的烟粉虱成虫50～70头,置于滴有50μL预冷的0.05 mol/L PBS无菌水(p H 7.0、含0.01% Triton X-100)的Parafilm膜上,用0.2 m L PCR管底部迅速将烟粉虱充分研磨匀浆,将匀浆液吸入预冷的1.5 m L离心管中,再取50μL PBS缓冲液清洗Parafilm膜与匀浆用的PCR管底部,并与匀浆液混合作为酶源。此步操作在冰浴上进行。待测酶液保存于4℃冰箱,24 h内使用。

1.4.2 保护酶活性的测定

烟粉虱的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的测定参照史亮等[22]的方法,并严格按照南京建成生物工程公司的试剂盒说明书进行。按照说明书依次加入各试剂后, SOD、CAT和POD活性分别于550、405和470 nm波长处测定其吸光值,对照管中加入PBS缓冲液代替酶液。酶活性测定重复3次,取平均值。3种保护酶活性的计算公式详见刘建业等[23],保护酶活力单位为U/mg pro。

1.5 酶源蛋白质含量测定

采用Bradford考马斯亮蓝G-250法[24],按照蛋白定量试剂盒说明书进行,以牛血清白蛋白(BSA)含量为自变量,测定的OD值为因变量制作蛋白标准曲线,重复3次;用于解毒酶和保护酶活性测定的待测酶液,与考马斯亮蓝混匀后再静止放置10 min,测定595 nm处的吸光值,根据蛋白标准曲线计算待测酶液的蛋白含量。

1.6 数据分析

烟粉虱的酶活性均采用平均值±标准误(standard error,SE)来表示,测定数据采用Excel进行处理,方差分析采用SPSS软件(SPSS for Windows,Rel.17.0.0 2009.Chicago：SPSS Inc.)进行,并采用Fisher’s LSD法进行差异显著性分析(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 TYLCV对B型和Q型烟粉虱解毒酶活性的影响

B型烟粉虱在感染TYLCV的番茄寄主上取食72 h后,其羧酸酯酶(Car E)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和P450酶系的活性较对照均有不同程度的升高,其中羧酸酯酶活力升高最明显,从(30.22± 2.05)OD/min/mg pro升高到(63.39±6.48)OD/ min/mg pro,差异达极显著水平(P＜0.000 1), P450活性较对照也升高,差异达显著水平(P＜0.05),GSTs活性在B型烟粉虱中升高不显著,而在Q型烟粉虱中升高显著;而当烟粉虱在带毒番茄寄主上饲养30 d后,其体内的GSTs和Car E活性均下降,低于在健康植株上饲养的对照种群的活性,但B型烟粉虱的P450酶活性[(26.60±0.64) nmol/mg pro/30 min]则显著高于对照及在带毒寄主上饲养72 h的种群,为对照种群的1.99倍(图1a)。整体上,Q型烟粉虱的解毒酶活性变化趋势与B型烟粉虱一致(图1a～b)。

图1 TYLCV对烟粉虱解毒酶活性的影响Fig.1 Effects of TYLCV on the activities of detoxification enzymes of Bemisia tabaci

2.2 TYLCV对B型和Q型烟粉虱保护酶活性的影响

与饲养在健康番茄上的烟粉虱相比,在感染TYLCV的番茄寄主上取食72 h的烟粉虱种群,其保护酶SOD、CAT、POD活性均有所升高。对于B型烟粉虱来说,在带毒番茄上饲养72 h,其POD活性[(5.430±0.43)U/mg pro]比取食健康番茄的烟粉虱POD活性[(1.683±0.15)U/mg pro]显著升高(P＜0.05);CAT活性也显著升高,但SOD活性与对照差异不显著;而当B型烟粉虱在带毒番茄寄主上饲养30 d时,其SOD、CAT和POD活性分别为(52.040±5.07)U/mg pro、(13.559±1. 32)U/mg pro和(8.446±0.62)U/mg pro,为对照种群的1.45倍、8.42倍和5.03倍,差异显著(图2a、c和e)。对Q型烟粉虱来说,在带毒寄主上饲养72 h时,仅CAT活性升高不显著;而饲养30 d后, CAT和POD活性与对照和带毒寄主上饲养72 h处理相比均显著升高,而SOD活性与对照种群,以及感病寄主上饲养72 h的种群无显著差异,(图2b、d和f)。

3 结论与讨论

昆虫对其接触的外源性物质的响应非常灵敏,其解毒酶系的活性可以被外源化合物诱导,使昆虫在受到外界环境变化的压力时迅速反应并做出调整,而保护酶的作用则帮助协调昆虫的自由基控制在一个较低水平,维持昆虫正常的生理活动[23]。烟粉虱取食感染双生病毒的寄主植物会获得病毒,虽然已有研究表明双生病毒能够通过降低寄主植物的防御能力来提高烟粉虱的适合度,使之能够更好地适应和取食,这种互惠关系在双生病毒与Q型烟粉虱的互作关系中表现得更明显[25-26]。但可以推测,烟粉虱在带毒寄主植物上取食及其与病毒互作的过程中,也要调整自身生理并做出防御反应以适应病毒的进入,因此烟粉虱体内生理指标会发生变化。

本研究表明,烟粉虱在带毒番茄上饲养初期(72 h),烟粉虱获得病毒后,体内解毒酶活性会有短暂的诱导升高现象(图1),表现为病毒对烟粉虱解毒酶活性的短期诱导作用;但在带毒植物上饲养时间延长为30 d后,解毒酶GSTs和Car E活性又开始下降,甚至低于对照处理,这与以前的研究结果是吻合的,当B型烟粉虱在健康和感染中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)的烟草寄主上取食后,在带毒寄主上取食的烟粉虱的解毒酶基因的表达表现为下调,推断其可能是通过降低解毒酶活性来减少能量消耗,由此增加其在带毒寄主植物上的适合度[14]。同时本研究也表明,当烟粉虱在感染双生病毒的番茄植株上长期饲养时,仅有P450酶活性呈现持续升高现象,这与方勇[27]报道的烟粉虱携带TYLCV后,对阿维菌素、噻虫嗪、吡虫啉、氯虫苯甲酰胺、联苯菊酯等5种药剂的敏感性均有不同程度的下降的结果也是相符的。而烟蚜[Myzus persicae(Sulzer)]在感染黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的烟草上长期饲养后,其GSTs活性低于健康烟草上烟蚜的GSTs活性,然而CarE活性高于健康烟草上烟蚜[28],和本研究中部分结果存在差异,可能与供试的昆虫、病毒及植物种类不同有关。

图2 TYLCV对烟粉虱保护酶活性的影响Fig.2 Effects of TYLCV on the activities of protective enzymes of Bemisia tabaci

不同寄主植物对烟粉虱的生长发育、存活和繁殖等有不同的影响[2930]。昆虫体内的保护酶系统,在受到植物次生物质诱导或者其他外界刺激时会发生变化,昆虫体内抗逆性和耐药性都与它们保持着密切关系。在正常状况下,细胞内存在自由基清除系统,其中SOD能清除部分自由基而形成H2O2,而POD、CAT具有分解H2O2的作用,三种保护酶系协同作用使得生物细胞内的自由基维持在较低水平,不会引起对机体的伤害[31]。带毒番茄作为寄主植物饲育烟粉虱后,烟粉虱体内的3种保护酶(SOD、CAT、POD)活性会随着饲养时间的延长而呈现逐渐升高趋势。已经证实,昆虫体内这些保护酶活性的变化与昆虫的抗逆性和寄主适应性之间有密切关联[32]。本文研究结果与以往报道一致,白背飞虱[Sogatella furcifera(Horváth)]取食感染水稻黑条矮缩病毒的稻株后,其成虫体内保护酶(CAT、SOD和POD)活性也显著增强,生物学参数提高;褐飞虱取食后体内保护酶活性也表现相同趋势,表明水稻感染黑条矮缩病毒后,白背飞虱和褐飞虱的取食及生长发育的适应性均明显提高[15,33],结合本研究结果,说明植物病毒对传毒介体昆虫和非介体昆虫体内的防御酶活性均有明显或显著影响,昆虫取食带毒植物后可诱导其自身保护酶活性的升高。烟粉虱对带毒寄主植物的适应过程也属于克服逆境的过程,因此它在适应过程中体内保护酶活性增加,有利于其抵抗体内活性氧的增加,使之更好、更顺利地在带毒植物上生存,所以在带毒寄主植物上烟粉虱(包括B型和Q型)表现为繁殖力增加、寿命延长等[67]。另外,烟粉虱携带双生病毒TYLCV后,所测试的3大保护酶的变化趋势不完全一致,这可能与他们具有不同的作用机制有关。本研究中,Q型烟粉虱保护酶活性变化趋势与B型烟粉虱稍有差异,尤其是SOD活性,Q型烟粉虱在感染TYLCV的番茄植物上繁殖1代后,其SOD活性与饲养72 h时无显著差异,甚至还略有下降(图2),推测Q型烟粉虱在携带TYLCV病毒后的生理防御变化和对带毒寄主的适应性比B型烟粉虱更快。

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(责任编辑：杨明丽)

Effects of feeding on TYLCV-infected tomato on detoxification enzyme and protective enzymes of Bemisia tabaci(Gennadius)

Cao Zeng, Wang Jinna, Zhang Youjun, Wu Qingjun, Xie Wen, Wang Shaoli

(Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

In order to explore the physiological response of sweetpotato whitefly,Bemisia tabaci(Gennadius)infected with Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV),the detoxification enzymes and protective enzymes activity of B.tabaci were measured by using biochemical analysis.The results showed that the activities of GSTs and Car E increased after the B.tabaci biotype B were reared on viruliferous tomato plant for 72 h,and decreased when kept on the viruliferous tomato for 30 d.The P450 activity of B.tabaci biotype B was proved to be increasing significantly by 1.99 fold,compared to B.tabaci reared on the healthy plant.The activities of protective enzymes including SOD, CAT and POD in B.tabaci biotype B increased after feeding on viruliferous plant for 72 h,and continued increasing when reared on the TYLCV-infected tomato persistently,reaching 1.45 fold,8.42 fold,and 5.03 fold with signicant difference compared to the control,respectively.B.tabaci biotype Q exhibited similar trend as biotype B.These results provide more information for demonstration of the mutualism between whitefly and begomovirus and the adaptive mechanism of B.tabaci.

Bemisia tabaci; Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV); detoxification enzyme; protective enzyme

S 433

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.018

2014-09-29

2014-11-15

国家自然科学基金项目(31171857);公益性行业(农业)科研专项(201303019);农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室

*通信作者 E-mail：wangshaoli@caas.cn