不同强度运动大鼠心肌解偶联蛋白2表达及能量代谢变化研究

李晓燕，孟可，张红明，纪丽丽，张国明，晋群，陈英剑

不同强度运动大鼠心肌解偶联蛋白2表达及能量代谢变化研究

李晓燕，孟可，张红明，纪丽丽，张国明，晋群，陈英剑

目的探讨不同强度运动对大鼠心肌线粒体解偶联蛋白2(UCP2)表达的影响及其与心肌能量变化的关系。方法雄性Wistar大鼠45只，随机分为安静对照组，渐进训练组、渐进训练力竭组，每组15只。4周后，测定血清游离脂肪酸(FFA)浓度及心肌线粒体三磷酸腺苷(ATP)含量，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blotting测定心肌线粒体UCP2的表达变化。结果渐进训练力竭组ATP含量明显低于安静对照组与渐进训练组(P<0.01)；渐进训练力竭组血清FFA浓度明显升高，分别是安静对照组和渐进训练组的2.0倍和1.7倍(P<0.01)。RT-PCR及Western blotting结果显示，与安静对照组及渐进训练组相比，渐进训练力竭组心肌线粒体UCP2 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01)。相关性分析显示，心肌线粒体UCP2的表达与血清FFA浓度呈正相关(r=0.795，P<0.01)，而与ATP含量呈负相关(r=－0.843，P<0.01)。结论力竭运动训练可引起大鼠血清FFA浓度升高及心肌线粒体ATP含量降低，同时可诱导心肌线粒体UCP2表达。UCP2的表达与FFA浓度呈正相关，而与ATP含量呈负相关，提示UCP2可能参与了力竭运动中心的肌能量代谢。

运动；解偶联蛋白2；线粒体，心脏；能量代谢

近年来，运动性猝死在运动及训练中的发生率呈逐年上升趋势，特别是在长跑、足球、高强度军事训练等大强度运动中，但其发生机制尚不清楚。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，细胞生命活动95%的能量来源于线粒体。研究表明，高强度运动后心肌细胞出现一系列病理性变化，如大量线粒体发生肿胀，膜结构不清，嵴结构紊乱、消失，基质颗粒消失，有的出现多个亮区或空泡，上述结构改变伴随线粒体功能的明显减退，能量产生减少，收缩功能减弱，膜两侧生物电失去平衡，可导致心肌细胞死亡[1]。解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)是线粒体内膜上的一种蛋白质，是心肌生物能量代谢及功能调节的重要分子[2]，可作为质子转运体将H+从线粒体内膜渗漏到基质中，降低线粒体内膜的电化学梯度，减少ATP的产生[3]。目前，不同强度运动对UCP2表达变化的影响尚不明了，本研究观察不同运动强度下大鼠心肌线粒体UCP2的表达变化及心肌能量代谢的改变，探讨UCP2在心肌能量代谢中的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Trizol(美国Invitrogen公司)，两步法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(美国Bio-Rad公司)，PCR引物及内参(大连宝生物工程有限公司)；亚细胞结构线粒体提取试剂盒(武汉博士德生物公司)；BCA蛋白质定量试剂盒(武汉博士德生物公司)；UCP2抗体(美国 Millipore公司)；SDSPAGE蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(江苏碧云天生物公司)；抗β-actin兔多克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG(H+L)、HRP(北京康为世纪生物科技有限公司)。大鼠ATP酶联免疫分析试剂盒。

1.2 模型建立及分组 雄性健康Wistar大鼠45只，3月龄，体重200±50g，国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食，由山东大学齐鲁医院心血管研究中心动物房提供。动物室温度18～23℃，湿度40%～60%。泳池体积为100cm×70cm×80cm，水深50cm，水温控制在28～32℃。所有大鼠先适应性喂养3d，并进行适应性游泳3次，每次10min。第4天进行完全随机分组，每组给予不同处理。①安静对照组：平时不运动，饲养条件与其他组相同，每当其他组小鼠训练时，此组小鼠也放入温度相同的浅水中相同时间。②渐进训练组：每周训练6d，每天训练1次。第一次下水10min，此后逐日累加，每日增加15min，到第一周末时游泳时间达到85min/ d，以后维持这一运动强度直至第4周。③渐进训练力竭组：每周训练6d，每天训练1次。第一次下水10min，此后逐日累加，每日增加15min，到第一周末时游泳时间达到85min/d，以后维持这一运动强度直至第4周。在运动的最后1d进行一次力竭运动。按Thomas等[4]报道的力竭标准：沉入水底超过10s或游泳动作明显不协调，捞出后无逃避反应且无法完成翻正反射。3组大鼠做完实验后均立即断头取血，取心脏。

1.3 血清游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)、心肌ATP含量测定 取样本前大鼠禁食12h，取血液样本，分离血清，置于–70℃保存。采用全自动生化分析仪测定FFA浓度。采用大鼠ATP酶联免疫分析试剂盒，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(A)值，通过标准曲线计算样品中ATP浓度，具体操作见试剂盒说明。

1.4 RT-PCR检测心肌线粒体UCP2表达 取大鼠新鲜心肌组织100mg，液氮下研磨，加入1ml Trizol试剂，反复吹打裂解心肌细胞，加入0.2ml氯仿剧烈震荡15s，于4℃下，12 000×g离心15min后取上清，加入0.5ml异丙醇，于15～30℃静置10min，于4℃下，12 000×g离心10min后弃上清，可见管底出现胶状沉淀，加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀，于4℃下，7500×g离心5min后弃上清，得到心肌组织总RNA。根据cDNA反转录操作说明进行反转录，反应体系均为20μl，反应条件：25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃ 10min，得到心肌组织cDNA。以β-actin为内参，根据SYBR Green荧光定量测定目的基因表达操作说明进行分析，反应条件：94℃ 20s、58℃30s、72℃20s，40个循环。结果以2–ΔΔCt表示。PCR引物：上游5'-CAAGACCATTGCACGAGAGG-3'，下游5'-CCCGAAGGCAGAAGTGAAG-3'，退火温度为59℃，共40个循环。内参β-actin荧光定量PCR引物序列：上游5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，退火温度为59℃，共40个循环。所有引物均由大连宝生物工程有限公司合成。

1.5 Western blotting检测心肌线粒体UCP2表达取大鼠新鲜心肌组织100～200mg，加入线粒体提取试剂A液，充分匀浆后采用低温差速离心法提取线粒体，加入预混的线粒体提取试剂B+C液，充分漩涡震荡后10 000×g离心15min，得到线粒体蛋白，冷冻保存。将提取的线粒体蛋白解冻后按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明，应用酶标仪测定595nm波长处A值，根据标准品浓度和A值绘制标准曲线，计算线粒体总蛋白浓度。取50μg蛋白，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5min，使蛋白质变性后上样，80V作用30min后，120V作用90min，电泳至溴酚蓝完全跑出，转膜90min，5%脱脂奶粉封闭90min，然后加入1:1000 UCP2抗体，4℃封闭过夜，第2天将膜取出用TBST洗3次，每次12min，然后加入辣根过氧化物酶标记的1:10 000山羊抗兔IgG，37℃孵育90min，TBST洗膜3次，每次12min，进行化学发光显影。采用凝胶分析系统Quantity One计算条带光密度值。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0对数据进行处理。所有数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，对血清FFA浓度及心肌组织ATP含量与UCP2表达的关系分别行简单直线回归拟合及相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠血清FFA浓度及心肌组织ATP含量变化4周后，渐进训练力竭组大鼠血清FFA浓度明显升高，较安静对照组和渐进训练组分别增加约2.0倍和1.7倍，差异有统计学意义(P<0.01)，渐进训练组血清FFA浓度与安静对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。渐进训练力竭组大鼠心肌线粒体ATP含量明显低于安静对照组和渐进训练组，差异有统计学意义(P<0.01)，安静对照组与渐进训练组比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 大鼠血清FFA浓度及心肌线粒体ATP含量变化(±s，n=15)Tab.1 Changes of serum FFA and myocardial mitochondria ATP in rats(±s, n=15)

表1 大鼠血清FFA浓度及心肌线粒体ATP含量变化(±s，n=15)Tab.1 Changes of serum FFA and myocardial mitochondria ATP in rats(±s, n=15)

(1)P<0.01 compared with control group; (2)P<0.01 compared with endurance exercise group

Group FFA(μmol/L) ATP(ng/ml) Control 215.00±49.49 14.54±0.11 Endurance exercise 265.00±17.32 14.03±0.27 Exhaustive exercise 433.33±28.87(1)(2) 10.89±0.36(1)(2)

2.2 各组大鼠心肌线粒体UCP2 mRNA表达量比较 渐进训练力竭组大鼠UCP2 mRNA表达(0.562±0.051)较渐进训练组(0.332±0.006)高69.28%，较安静对照组(0.390±0.013)高44.10%，差异均有统计学意义(P<0.01)，安静对照组UCP2 mRNA表达水平与渐进训练组比较差异无统计学意义(P>0.05，图1)。

2.3 各组大鼠心肌线粒体UCP2蛋白表达比较渐进训练力竭组UCP2蛋白表达较安静对照组升高41.52%(P<0.01)，较渐进训练组升高82.68%，差异均有统计学意义(P<0.01，图2)。

2.4 血清FFA浓度及心肌组织ATP含量与UCP2的相关性分析 相关性分析结果显示，大鼠心肌线粒体UCP2与血清FFA浓度呈显著正相关(r=0.795，P<0.01)，与心肌组织ATP含量呈显著负相关(r= –0.843，P<0.01，图3)。

图1 RT-PCR分析各组大鼠心肌线粒体UCP2 mRNA表达结果Fig.1 Expression of UCP2 mRNA in myocardial mitochondria of rats in each group (RT-PCR)A. Control group; B. Endurance exercise group; C. Exhaustive exercise group. (1)P<0.01 compared with exhaustive exercise group

图2 Western blotting分析各组大鼠心肌线粒体UCP2蛋白表达Fig.2 Protein expression of UCP2 in myocardial mitochondria of rats in each group (Western blotting)A. Control group; B. Endurance exercise group; C. Exhaustive exercise group. (1)P<0.01 compared with exhaustive exercise group

图3 FFA浓度及ATP含量与UCP2表达量的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of FFA, ATP and the expression of UCP2

3 讨 论

UCP2基因位于人类染色体的11q13，长6.5kB，含有7个内含子和8个外显子，编码308个氨基酸，相对分子质量为33 218[5]。线粒体通过氧化呼吸F0-F1ATP合酶将氢离子(H+)从线粒体基质转移到内膜，形成跨内膜质子的电化学梯度，释放的能量能促进二磷酸腺苷(ADP)与磷酸结合生成ATP，此过程即为氧化磷酸化偶联。然而，H+也可不通过F0-F1ATP合酶，而是跨膜扩散流入线粒体基质中，不生成ATP而释放热能，此现象称为“质子漏”[6]。UCP2具有“质子漏”功能，可使呼吸链传递电子过程中产生的H+不经过氧化磷酸化偶联，而是作为质子转运体直接将H+从内膜转运到线粒体的基质中，使ATP生成减少，并释放热量[7]。

本研究发现，渐进训练力竭组大鼠心肌线粒体UCP2 mRNA表达明显增高，较渐进训练组高69.28%，较安静对照组高44.10%，而安静对照组与渐进训练组比较差异无统计学意义，提示剧烈运动能明显增加UCP2的表达，而一般有氧运动时UCP2增加不明显。研究表明，一般强度有氧训练时，消耗的ATP及产生的自由基量不大，且生成的自由基在短时间内被清除，所致细胞和细胞器的损伤较轻，随着运动强度增加，ATP消耗增加，自由基的产生增多且不易被消除，细胞的损害也更趋严重且无法修复。急性疲劳运动时，心肌代谢耗能增加，可超出线粒体的承受能力，从而引起细胞功能障碍甚至死亡[8]，线粒体功能障碍主要表现为能量产生减少、收缩力减弱、膜两侧生物电失去平衡，最终导致心肌细胞死亡。UCP2蛋白在剧烈运动时表达增高，其质子漏功能使势能以热量形式无端消耗，而非转化成ATP，导致ATP生成减少，线粒体能量代谢降低，进一步恶化心脏功能，UCP2蛋白过量表达还能引起酸中毒，加重心力衰竭[9]。因此控制合理的运动强度，适当抑制UCP2表达可能是减少心肌损害的有效方法。

UCP2还可能参与调节运动机体脂肪酸的代谢过程[10]。FFA是机体主要的供能物质之一，正常心肌以FFA为主要能源。在心衰时心肌的有氧氧化过程发生障碍，对脂肪酸的氧化和乳酸的再利用减少，血中FFA浓度明显升高，FFA浓度过高会造成心肌损害，增加心肌的耗氧量，加重心肌缺血[11]。本研究结果显示，力竭运动后，渐进训练力竭组血清FFA浓度升高，较安静对照组与渐进训练组分别增加约2.0倍和1.7倍；相关分析证实，心肌线粒体UCP2表达与血清FFA浓度呈显著正相关，提示FFA浓度与UCP2表达密切相关。研究表明，高血清FFA水平与心源性猝死显著相关，抑制FFA进入线粒体可改善心肌损伤缺血状态[12]。

综上所述，不同运动负荷对线粒体UCP2表达及心肌能量代谢的影响不同：渐进训练时，UCP2表达及心肌组织ATP、FFA浓度与对照组相比无明显改变；力竭运动后，该结果表明，UCP2表达增高，ATP生成减少，FFA浓度增高。UCP2表达改变在急性力竭运动后心肌损伤发生发展过程中可能发挥重要作用，调控UCP2表达可能对改善急性损伤心肌线粒体功能紊乱有益。

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Effect of exercise intensity on the expression of UCP2 and energy metabolism in rat myocardium

LI Xiao-yan1, MENG Ke2, ZHANG Hong-ming1, JI Li-li3, ZHANG Guo-ming1, JIN Qun1, CHEN Ying-jian31Department of Cardiology,3Department of Medical Laboratory, General Hospital of Jinan Command, Jinan 250031, China
2Graduated School of Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121001, China
This work was supported by the 2014 Major Projects of PLA Logistics Research (AWS13C008)

ObjectiveTo study the effect of different exercise intensity on the expression of uncoupling protein 2 (UCP2) in mitochondria of rat myocardium, and investigate the correlation and significance between energy metabolism and UCP2.MethodsForty five male Wistar rats were randomly divided into 3 groups (15 each): normal control (NC) group, endurance exercise (EnE) group and exhaustive exercise (ExE) group. Four weeks later, both the serum concentration of free fatty acid (FFA) and the content of ATP in myocardial mitochondria were measured. The expression of UCP2 in myocardial mitochondria was assessed with RT-PCR and Western blotting.ResultsThe content of ATP was lower in ExE group than that in NC and EnE group (P<0.01). The serum FFA concentration in ExE group was 2.0 folds and 1.7 folds higher than in that of NC group and EnE group, respectively (P<0.01). The results of RT-PCR and Western blotting indicated that the expression of UCP2 in myocardial mitochondria was significantly up-regulated in ExE group as compared with that of NC and EnE groups (P<0.01). Correlation analysis showed a positive correlation between expression of UCP2 and serum FFA concentration (r=0.795,P<0.01), while a negative correlation was found between expression of UCP2 and ATP content (r=–0.843,P<0.01).ConclusionsExhaustive exercise may increase serum FFA concentration and decrease myocardial mitochondria ATP content, and it may induce myocardial mitochondria UCP2 expression at the same time. UCP2 expression is positively correlated with FFA concentration, but it was negatively correlated with the ATP content, implying that UCP2 may participate in the process of myocardial energy metabolism during exhaustion exercise.

exercise; uncoupling protein 2; mitochondria, heart; energy metabolism

R339.4

A

0577-7402(2015)10-0794-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.10.05

2015-03-27；

2015-06-25)

(责任编辑：张小利)

2014全军后勤科研重大项目(AWS13C008)

李晓燕，医学硕士，主任医师。主要从事心血管内科疾病的基础与临床研究

250031 济南 济南军区总医院心内科(李晓燕、张红明、张国明、晋群)，检验科(陈英剑)；121001 辽宁锦州辽宁医学院研究生院(孟可、纪丽丽)