丹参注射液对于急性胰腺炎大鼠血清中NF-κB、TNF-α、IL-6的影响①

王小全，艾迎春

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

丹参注射液对于急性胰腺炎大鼠血清中NF-κB、TNF-α、IL-6的影响①

王小全，艾迎春

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：通过对急性胰腺炎大鼠用丹参注射液时血清中NF-κB、TNF-α、IL-6的影响，从而探讨丹参对急性胰腺炎的治疗的疗效及机理。方法：45只清洁的雄性Wistar大鼠被随机分成为3组：即空白对照组(假手术组)、疾病模型组(AP组)和药物治疗组(丹参组)。在3h、6h、12h时在各组分别取5只大鼠，采用ELISA法测定并比较大鼠血清中的TNF-α、IL-6及采用WESTERN blotting检测胰腺组织NF-κBp65蛋白。结果：将模型组与对照组(假手术组)比较,TNF-α、IL-6的水平增高,胰腺组织NF-κB蛋白也升高(P<0.05);而治疗组(丹参组)上述指标与模型组相比均有下降(P<0.05)。结论：丹参注射液可能通过抑制AP大鼠NF-κB蛋白，从而降低血清中TNF-α、IL-6的浓度水平，控制AP炎症，从而对急性胰腺炎的治疗发挥作用。

NF-κB;TNF-α;IL-6;AP; 丹参注射液

急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是胰酶提前激活造成胰腺及周围组织消化所引起的急性炎症性疾病。其特点为病情严重，死亡率高，至今仍无突破性的治疗。常见的致死原因包括全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)，等等，这是不能用传统的胰腺自身消化理论充分解释。急性胰腺炎时有炎细胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8)等升高,而且其升高的幅度与急性胰腺炎的严重程度密切相关[1]。且它已经通过近几年的一系列实验，证明了对局部和全身组织损害相关的几种炎症介质(如IL-1，IL-6，TNF-α，等)，而核转录因子-κB是和这些炎症介质激活有关的[2]。NF-κB是一种DNA结合蛋白，在各种炎性及免疫反应中，是通过调节细胞因子和黏附分子的基因而表达[3]，具有基因转录调节作用，可参与AP炎性因子的调控，主要调节TNF-α、IL-6和IL-8等。而丹参注射液的作用可以改善外周循环、加快微循环血流速度、抗炎、调节免疫等。

本实验是采取通过采取逆行胰胆管注射4%的牛磺胆酸钠制备成AP模型，分别在3h、6h、12h时进行检测AP模型组及丹参注射液治疗组大鼠血清中的肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及胰腺组织中的核转录-κB蛋白水平的变化。探讨丹参注射液对急性胰腺炎大鼠的NF-κB表达的影响及TNF-α、IL-6的影响，验证丹参注射液是否能通过抑制AP大鼠NF-κB蛋白，降低血清中TNF-α、IL-6的浓度水平，控制AP炎症反应，从而对急性胰腺炎的治疗发挥作用。

1 材料及方法

1.1 实验动物及分组

选取45只清洁健康的Wistar大鼠,雄性,体重200～250g,采用统计学方法将其随机均分为3组,即空白对照组(假手术组), 疾病模型组(AP组)和药物治疗组(丹参组)，每组各15只。

1.2 实验方法

1.2.1 建立急性胰腺大鼠模型

Wistar大鼠被适应性喂养7d,在进行术前的12h只喂水即禁食不禁水。

对照组只行开腹，对胰腺组织只进行轻柔处理。 模型组，采取由Aho等[4]提出的诱导急性胰腺炎的方法：将4%的牛黄胆酸钠逆行胆胰管注射。术前采用10%水合氯醛溶液(0.4mL/100g)进行腹腔注射麻醉，麻醉后，将大鼠在实验台上处于仰卧位，并且四肢被固定于实验台上，开始准备：备皮，消毒，铺巾。在中上腹部即胃区行正中切开，开腹后沿胃的幽门向下找十二指肠，从而找到胰胆管，将胰胆管进入十二指肠处暴露出来，在胰胆管开口对侧肠壁上用穿刺针行穿刺，进入肠腔后，在使穿刺针穿入胰胆管内，再将胆胰管上下端闭合，注入4%牛磺胆酸钠(0.1mL/100g)制备AP模型(注射速度0.2mL/min)，持续3min后，可观察到胰腺组织的改变即水肿、充血、坏死等，然后使胆胰管恢复畅通，拔穿刺针，指压穿刺点，检查有无漏胆，在进行器官复位，关腹后将切口包扎并固定。

治疗组，AP制模成功后给予丹参注射液以8g/kg经尾静脉注射。

1.2．2 标本采集及检测指标

各组于3、6、12h时间点各取5只大鼠(1)经心脏采血，分离血清后，采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠血清中TNF-α、IL-6。(2)采集胰腺组织NF-κBp65 蛋白表达的分析(Westernblotting检测)。

1.3 统计学方法

2 结果

造模后分别在3h、6h、12h时，与对照组对比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平及胰腺组织中NF-κBp65蛋白水平与对照组均明显增高(P<0.01)；与模型组对比，治疗组各时间点的大鼠血清中的TNF-α、IL-6水平及胰腺组织中NF-κBp65蛋白水平均显著降低(P<0.05)，但并未恢复到正常水平。见表1～3。

分 组TNF-α 3h 6h 12h对照组(假手术组)81．40±8．3683．13±7．0186．58±7．65模型组(AP组)218．77±21．23∗258．60±21．28∗315．41±25．39∗治疗组(丹参组)189．00±15．05△227．57±18．04△278．54±24．97△

与对照组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.05。

分 组IL-6 3h 6h 12h对照组(假手术组)124．45±10．16132．49±11．24139．56±10．50模型组(AP组)188．52±15．93∗219．93±17．76∗369．47±17．59∗治疗组(丹参组)163．70±12．68△193．41±15．85△340．07±17．87△

与对照组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.05。

分 组NF-κB 3h 6h 12h对照组(假手术组)0．68±0．060．72±0．060．78±0．07模型组(AP组)0．88±0．08∗1．04±0．08∗1．30±0．11∗治疗组(丹参组)0．77±0．06△0．91±0．07△1．12±0．10△

与对照组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.05。

3 讨论

丹参为中药,其性味较苦,微寒,其功效具有活血祛瘀,凉血消痈等作用，是我国的传统中药。据有关研究均提示，丹参中的成分具有改善外周循环、加快微循环血流速度、增加毛细血管网、抗炎、调节免疫、提高低压条件下肌肉的耐缺氧能力及改善缺血再灌注损伤等作用[5，6]。丹参成分当中含有多种抗菌、抗炎成分，而隐丹参酮是丹参的主要成分，且抗菌、抗炎效果也较突出。其对葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型链球菌变形杆菌等表现出较强的抑菌作用，而对炎症引起的肿胀、感染引起的肿胀均具有一定功效，能使腹膜炎的炎症渗出明显减少，抑制白细胞游走，从而使中性粒细胞的趋化性明显降低。而丹参注射液是中药制剂，丹参酮、丹参素为主要成分，还有多种物质成分，其作用主要表现在对活血化瘀、降低血黏稠度及促进和改善微循环中，从而对炎症的恢复有一定的作用[7]。

急性胰腺炎是常见的消化系疾病，目前的发病机制仍不清楚，导致缺乏适当的治疗AP的治疗策略。最关键的一点是胰腺坏死的发展，往往会发展为全身性炎症反应综合征(SIRS)，10%～30%近似的死亡率，在重症急性胰腺炎的大多数形式的死亡是由于感染和多器官功能障碍综合征(MODS)。传统的如胰腺自身消化理论或微循环障碍理论不能令人满意地解释SIRS、MODS的发生，甚至死亡。然而，最近提出的炎症介质理论为急性胰腺炎的研究提供了新的线索[8]。 正是在这一理论解释说，在早期阶段急性胰腺炎，异常激活胰酶破坏邻近胰腺细胞，导致局部炎性细胞浸润。激活的炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、胰腺腺泡细胞产生和释放炎性细胞因子[9]。炎性细胞因子的升高程度与AP的严重程度密切相关，而正是这些炎性细胞因子的导致SIRS和MODS的发生。目前比较公认的炎性细胞因子有TNF-α和白细胞家族成员(IL-6、10、18)等[10]。急性胰腺炎的炎症刺激使受累组织和网状内皮细胞产生一系列的细胞因子,其主要的促炎因子为TNF-α和IL-6,起重要作用表现在炎症反应和器官损害中[11]。NF-κB是一个具有基因转录调控作用的蛋白质，可以参与许多炎症因子的调节作用[12]，有5种NF-κB/Rel家族成员在哺乳动物的细胞中：分别是RelA(p65)、RelB、原癌基因c-Rel、NF-κB1(p50/p105)和NF-κB2(p52/p100)[13]。TNF-α和IL-6是受NF-κB的调节的，NF-κB是通过所在的NF-κB对TNF-α及IL-6启动的结合位点进行调节的[14]。经研究，活化的NF-κB能导致细胞因子表达增加，如TNF-α，IL-6，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，导致免疫反应和炎症反应的发生[15]。本实验结果表明，模型组(AP组)是造模后3h、6h、12h血中TNF-α、IL-6水平及NF-κB的表达增高且与正常对照组比较，具有差异性意义(P<0.01)，治疗组(丹参组)是造模后给予丹参注射液治疗后可明显低于模型组中的大鼠血清中TNF-α、IL-6的水平及NF-κB的表达，具有差异性意义(P<0.05)，提示丹参注射液可能通过抑制AP大鼠NF-κB的活性，从而降低血清中TNF-α、IL-6的浓度水平，控制AP炎症反应，从而对急性胰腺炎的治疗发挥作用。

本研究表明：丹参注射液对急性胰腺炎的治疗有一定的作用，其作用机制可能通过抑制AP大鼠NF-κB蛋白，从而降低血清中TNF-α、IL-6的水平，控制AP的炎症反应，其具体机制尚有待进一步研究。

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The effect of Salvia miltiorrhiza injection on NF-kappa B,TNF-α, IL-6 in the serum of rats with acute pancreatitis

WANGXiao-quan，AIYing-chun

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Objective: To study the effect of Salvia miltiorrhiza injectionon NF-kB, TNF-α,IL-6 in the serum of rats with acute panc-reatitis,and to explore the effect and mechanism of Salvia miltiorrhiza injection in the treatment of acute pancreatitis. Methods: Wistar rats were randomly divided into three groups: control group(sham group),model group(group AP) and treatment group(group Salvia miltiorrhiza),with 15 in each group.Five rats in each group were selected in 3h, 6h and 12h respectively. The TNF-α,IL-6 in their serum were observed and compared by using the method of ELISA.The NF-kBp65 proteins in pancreatictissue were detected by using Western blotting method. Results:Compared with control group(sham group),the levels of TNF-α,IL-6 in model group(group AP)were increased,and NF-kB expression in pancreatic tissue were increased(P<0.05).Theaboveindexesoftherapygroup(groupSalviamiltiorrhiza)weredecreasedcomparedwiththemodelgroup(P<0.05). Conclusion: Salvia miltiorrhiza injection may reduce the concentration of TNF-α,IL-6 in serum,and control AP inflammation by the inhibition of AP rats NF- kB, which plays a role in treatment on acute pancreatitis.

NF-κB；TNF-α；IL-6；AP；Salvia miltiorrhiza injection

佳木斯大学科研生科技创新项目，编号：LM2014-014。

王小全(1987～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

艾迎春(1960～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail:41006735@qq.com。

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1008-0104(2015)01-0058-03

2014-11-19)