靛蓝在虹鳟鱼体内定位分布的放射自显影研究

高 锴，何若竹，檀翠玲，罗彦鹤，闫 佩，Maria E. Jönsson，Ingvar Brandt，周启星

(1. 天津市环境保护科学研究院 天津300191；2. 南开大学环境科学与工程学院 天津300071；3. 瑞典乌普萨拉大学进化生物学中心环境毒理学系 瑞典SE-75236)

靛蓝在虹鳟鱼体内定位分布的放射自显影研究

高 锴1,2,3，何若竹2，檀翠玲1*，罗彦鹤1，闫 佩1，Maria E. Jönsson3，Ingvar Brandt3，周启星2

(1. 天津市环境保护科学研究院 天津300191；2. 南开大学环境科学与工程学院 天津300071；3. 瑞典乌普萨拉大学进化生物学中心环境毒理学系 瑞典SE-75236)

以虹鳟鱼为实验鱼类，通过水浴实验，以CYP1诱导剂(PCB126)为研究对象，分析了靛蓝在鱼全身代谢的动力学情况。通过放射自显影方法并利用放射性14,C标记的靛蓝(18,nM)进行水浴暴露实验，结果表明：实验开始20,min后靛蓝消化于胆液中；在随后的实验中(暴露 3～24,h)，在胆汁的排泄途径中发现高浓度的标记物。在鱼鳃中也存在高浓度的标记物；换水后，其放射性浓度逐渐降低。同时观察到嗅觉器官中有选择性的标记，肾脏和肝脏中吸收的放射性物质浓度低于鳃。比较暴露于二甲基亚砜(DMSO)和CYP1诱导物PCB126的鱼，其14,C-靛蓝总体布局模式相似。CYP1抑制剂玫瑰树碱可以阻拦14,C-靛蓝在鱼鳃中的积蓄。

靛蓝 放射自显影 虹鳟鱼

靛蓝(Indigo)是一类吲哚衍生物，其色素广泛应用于印染业。据统计，全球每年消耗 50,000,t靛蓝用于牛仔面料的生产。[1]靛蓝存在两种氧化还原状态(见图1)，一种是中性的且呈深蓝色的氧化态，由于酮基与 NH结构中的分子间氢键作用而形成的平面形状的高度稳定结构；[2]另一种是无色的还原状态(也称为“白靛蓝”)，是染色过程中的一种溶于水的物质。浸泡在白靛蓝的面料经风干后，空气中的氧会将白靛蓝氧化成稳定的、深蓝色的酮基态。[3]

由于靛蓝被认为是一种极为稳定的物质，其在纺织业的广泛应用对环境造成的影响引起了研究人员的关注。[4]Campos等曾做过调研，认为在牛仔布料的生产加工过程中，白靛蓝会随着废水被排放到自然界中。[5]另外，日常生活中对经靛蓝染色衣物的清洗会使面料褪色，而使靛蓝随污水排放到污水处理厂。由于其溶解性较低，靛蓝通常会被吸收在底泥中，但截至目前还没有相关报道证实这一点。

图1 靛蓝和白靛蓝分子结构Fig.1 Molecular structures of indigo and white indigo (leuco form)

虽然目前关于人类对于靛蓝的环境暴露问题以及日常生活中皮肤吸收蓝色牛仔裤面料中的靛蓝状况等相关信息并不清楚，但是在中医学领域中，靛蓝早已被用于治疗各种皮肤病(如牛皮癣等)及慢性粒细胞白血病。[6-8]在治疗牛皮癣的研究中发现，青黛(从板蓝的茎和叶中提取)和靛玉红(靛蓝异构体)可以抑制表皮生长因子受体(EGFR)的活性、表皮生长因子诱发CDC25B基因表达和人类表皮角质细胞的增殖。[9]

关于靛蓝对人类的影响，Adachi等[10]最先在人体内发现了靛蓝，通过对非患病人类尿液水解等方法提取了靛蓝与其异构体青黛，从而证明人体能通过正常的代谢途径形成靛蓝类物质；此外，还通过基于酵母系统的实验，证明在人类芳烃受体(AhR)和芳香烃受体核转运蛋白(ARNT)基因协同表达中，靛蓝和靛红均是芳烃受体(AhR)强力的诱导剂。[10-11]另外，还有研究表明，啮齿动物通过腹腔内注射或者口腔暴露靛蓝后，在肝脏中没有产生明显CYP1A1的诱导效果，有可能是由于靛蓝的快速代谢造成的。[11-12]

当前，国外开展了靛蓝作为内源性 CYP1诱导剂的相关研究，但是靛蓝在鱼中的吸收、代谢及动力学研究还鲜有报道。鉴于此，本研究选取虹鳟鱼为实验动物，尝试应用核素显像手段分析放射性14,C标记的靛蓝(14,C-靛蓝)在虹鳟鱼体内的吸收、组织定位和排出路径，评价利用14,C-靛蓝在检测CYP1内源性激动剂应用的可行性，为此类化学物的毒理学分析提供依据。

1 原料与方法

1.1 动物与化学物质

虹鳟鱼[(68±7),g；(18±1),cm；Mean±SD]购于 Näs fiskod-ling公司(瑞典)，养于乌普萨拉大学进化生物学中心(EBC)水生动物实验室，水温保持在 11,°C。3，3’，4，4’，5-五氯联苯(PCB 126；化学文摘号：57465-28-8)购于Larodan(Malmö，Sweden)；靛蓝(CAS：482-89-3)购于 Sigma公司(St Louis，MO，USA)。14,C-靛蓝(比活性：55,mCi/mmol；放射化学物纯度：98 %,)由 OncoTargeting 公司(Uppsala，Sweden)提供。二甲基亚砜(DMSO)用作PCB126与Indigo的载体溶剂。

1.2 暴露实验

实验在透明的聚乙烯袋子(45×90,cm；Gibbon公司，瑞典)中进行。将袋子放在箱子(35×20×19,cm)里后，注入20,L水并持续曝气。实验步骤及实验动物取样方案如表1所示。在第 1组(实验对照组)中，7条鱼用二甲基亚砜(DMSO，2.5,μg/mL)预处理24,h后，在含14,C-靛蓝(18,nM)水体中暴露24,h，在处理 20,min、2,h、6,h、12,h、24,h、24,h＋1,d(换水后)及24,h＋2,d后取样。第2组的7条鱼经PCB126(10,nM)预处理后暴露 24,h后，在含14,C-靛蓝(18,nM)水体中暴露 24,h。第3组用于检验14,C-靛蓝在鱼体内吸收是否受到CYP1抑制剂玫瑰树碱的影响。和第2组相似，3条经过PCB126预处理的鱼在暴露于14,C-靛蓝之前，在玫瑰树碱里暴露30,min。分别在暴露于14,C-靛蓝12,h、24,h及24,h＋2,d后取样。使用乙酸作为溶剂配置玫瑰树碱溶液母液，加入玫瑰树碱溶液于水后，形成1,µmol的玫瑰树碱和10,μg/mL的乙酸溶液，使暴露环境pH值从8.0降至7.8。按Ullberg[13]放线自显影方法，将所有的鱼进行冷冻切片处理；处理前取鱼部分(右侧)鳃丝、嗅觉器官、肾脏及小肠组织，固定在 10%,的甲醛中，以备进行光学显微镜放射自显影检测。

1.3 放线自显影法

实验动物按表 1所述方案取样，杀死鱼后将其固定在羧甲基纤维素(1%,)水凝胶中，冻结在用干冰(-72,℃)冷却的己烷中。用超薄切片机进行全身水平切片(20,µm)并放在胶带表面上(3M 公司，美国)。[13-14]将切片在-20,℃冷冻干燥后，置于X射线胶片上(Agfa Structurix胶片)并保存于-20,℃下，所有切片暴露30,d。

表1 暴露实验方案与取样时间Tab.1 Exposure protocols and sampling times

1.4 显微放线自显影法

虹鳟鱼经14,C-靛蓝暴露 12,h后，用含有 1.5%,(v/v)戊二醛和1.5%,(v/v)甲醛的磷酸缓冲液(0.1,M，pH 7.4)固定保存鱼的组织(鳃、嗅觉器官、肾脏和小肠)24,h。用 70%,(v/v)乙醇冲洗固定后的组织，于室温下脱水晾干。用乙醇(96%,)将样品进一步脱水后，用超薄切片机(2,μm)切片并置于载玻片上(Thermo Scientific公司，德国)。用蒸馏水洗涤后，使用Kodak NTB-2(Kodak公司)乳化显影后置于2,℃冷藏3个月，用甲苯胺蓝进行背景染色。最后用光学显微镜进行切片分析(放大100～400倍)。

2 结 果

为了检验14,C-靛蓝的生理处置是否受 CYP1代谢影响，实验比较了对照组(第1组)与PCB126处理组(第2组)放射自显影像图。结果显示，在放射性物质的分布上，两组之间不存在明显的区别。然而，从整体看来，PCB实验组比对照组的鱼鳃中有更明显的由14,C-靛蓝衍生的放射性物质积累。

由放射自显影像观察，14,C-靛蓝在水中很快由鱼鳃快速吸收后立即从肝脏代谢分泌到胆汁中(20,min，见图2a)。随后(2～24,h暴露于14,C-靛蓝及换水后1～2,d)，在胆汁和小肠中(见图2b～2g)出现较高浓度的放射性物质。在整个暴露14,C-靛蓝期间，鳃丝中观察到较高浓度放射性物质积蓄(见图2a～2e)，但将鱼放在淡水中净化后，标记物浓度逐渐下降(见图2f～2g)。在 6～12,h时，观察到在嗅觉器官(见图2d)与肾脏(可能出现在肾小管，待检)里有14,C-靛蓝衍生的放射性物质吸收和保留。在暴露的前期(20,min)，肝脏与肾脏中的标记物浓度相近；但在随后的暴露中(24,h，24,h＋1,d，24,h＋2,d)，肾脏中存在的放射性物质比肝脏中明显。

图2 暴露于14C-靛蓝中虹鳟鱼的射线自显影图Fig.2 Autoradiograms of rainbow trout exposed to14C-indigo via water

实验用PCB 126处理组暴露CYP1抑制剂玫瑰树碱，使14,C-靛蓝在鳃中的累积几乎被完全限制(见图3)；暴露于玫瑰树碱的鱼中嗅觉器官表皮细胞标记物也减少了。基于半定量的对放线自显影像图半定量评估，在胆和肠中的放射性物质似乎没有受到排泄的影响。

图3 使用CYP1抑制剂玫瑰树碱处理后对照图Fig.3 Autoradiograms showing the head region of PCB 126-treated rainbow trout after 12,h of exposure to14C-indigo in water

3 讨 论

细胞色素 P450是一种混合功能氧化酶，这种单氧加氧酶体系(CYP)可以将进入组织的有机或无机物质氧化代谢，因此它在对外源性生物质(exogenous chemicals)的代谢、毒物降解和维持鱼类生态平衡上发挥着重要的作用，而且还催化内源性物质(endogenous chemicals)的生物合成、降解。以往大多数研究都集中在CYP1A亚科，是由于CYP1A可以作为一种生物标志物指示外源化合物如多环芳烃(PAHs)、多氯联苯(PCBs)、多氯代二恶英(PCDDs)和多氯代苯并呋喃(PCDFs)等环境污染物的暴露。[15]此外，相关研究认为 CYP450 一些同工酶的变化与肿瘤、肾上腺增生性疾病、巴金森氏疾病等的发展有关。但是，对于内源性CYP1诱导剂的相关报道并不多见。靛蓝作为天然的植物成分，是兼备内、外源性 CYP1诱导剂的性质，深入分析靛蓝的体内代谢动力学不仅有利于了解其毒理学机理，而且对探索由其引发的相关疾病的保护策略等有着非常重要的意义。结果显示，鱼鳃可从水环境中快速摄取靛蓝，并能以水溶性代谢物形式很快从胆和肠道中代谢消除。鱼鳃丝积蓄了高浓度靛蓝衍生物，这与研究早期发现的结果一致，即鱼鳃作为直接暴露于水环境的组织，与水中存在的14C-靛蓝直接接触，诱导鳃丝中存在的 CYP1酶产生作用；由于首过效应，肝脏对靛蓝衍生物的吸收程度亚于鳃，这也解释了在同一暴露条件下肝脏EROD活性低于鳃。[16]

研究人员利用酶法(β-葡萄糖醛酸酶)或化学方法(硫酸，pH＝2)水解从人类尿液中提取出了靛蓝。通过进一步实验发现，靛蓝可以诱导在酵母细胞系统中AhR与ARNT的表达，从而表明靛蓝是以共轭形式从人类尿液中排出的。基于本研究的放射自显影结果，表明靛蓝在鱼类中的代谢途径与人类相似。本文开头所述，靛蓝存在两种氧化还原形态，天然的酮基形式以及无色还原形式；虽然共面的酮基结构是 AhR激动剂，但酚基结构却很有可能无法激活AhR。目前虽然我们还未能证实靛蓝向白色靛蓝的生物转化过程，但 Sugihara[12]此前也提出相似的理论，根据 EROD在人类肝细胞产生短暂的激活反应，提出了靛蓝(以及靛红)在细胞培养过程中会以还原状态(无色形式)出现。经14,C-靛蓝暴露 20,min后，在虹鳟鱼胆汁及尿液中观察到高剂量放射性排泄物很可能是还原型的白靛蓝，随后形成羟基共轭物。作为平面分子和 CYP1A的诱导物，靛蓝能够被 CYP1A羟基化；但是经 CYP1A抑制剂玫瑰树碱预处理的鱼的14,C-靛蓝的代谢消除率没有受到影响。由此可见，尽管14,C-靛蓝(18,nmol)可以诱导CYP1A的表达，但由 CYP1A介导的新陈代谢对虹鳟鱼靛蓝的排泄消除并不起主要作用。

在鳃丝中由能观察到对放射性快速积累和持久保留，但原因尚不清楚。当考虑靛蓝诱导 EROD及 CYP1A表达时间非常短暂，[16-17]靛蓝在鳃丝中滞留时间不应该很长。然而，高浓度标记物的积蓄表明是靛蓝自身(或者其代谢产物)被束缚在鳃丝上。在显微放射自显影实验中，使用溶剂处理后，结果清晰表明，鳃丝上积蓄的放射性物质不是由活性中间代谢物(共价)与组织不可逆结合后形成的。在这点上，靛蓝的性质与另一种 CYP1激动剂苯并[a]芘完全不同，后者经暴露处理后不可逆转地绑定在二级鳃丝上。[18]经 CYP1强效抑制剂玫瑰树碱处理后，鱼鳃中对靛蓝的摄取完全被阻拦，[18]可见鳃对靛蓝的摄取是 CYP1诱导依赖性的，表明与 CYP1的结合亲和力强但过程可逆。

我们在嗅觉器官上皮细胞也发现了标记物的吸收。虽然有报道称嗅觉器官上皮细胞(经 PCB126预处理)可以与苯并[a]芘产生不可逆的结合，但在未经 PCB126诱导的鱼中却没有发现此现象。[18]

4 结 语

本实验采用放射自显影技术首次对 CYP1诱导剂靛蓝在虹鳟鱼体内的吸收、分布、排泄等情况提供了初步的形态学依据。对进一步研究分析 CYP1类诱导剂可能对有机体产生的影响及作用机制提供了科学依据。■

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Autoradiographic Disposition of Indigo in Rainbow Trout

GAO Kai1,2,3，HE Ruozhu2，TAN Cuiling1*，LUO Yanhe1，YAN Pei1，JÖNSSON E．Maria3，BRANDT Ingvar3，ZHOU Qixing2
(1．Tianjin Academy of Environmental Sciences，Tianjin 300191，China；2．College of Environmental Science and Engineering，Nankai University，Tianjin 300071，China；3．Environmental Toxicology of Evolutionary Biology Center，Uppsala University，Uppsala SE-752 36，Sweden)

In the study，the whole-body kinetics of indigo in rainbow trout was examined through exposure via ambient water．Determined by autoradiography，there was an uptake of14,C-indigo(18,nM)from the water and a subsequent elimination into the bile within 20,mins．At later time-points(3-24,h of exposure；24,h of exposure plus 1-2days in clean water)，high concentration14C labelled substances were present in the biliary excretory pathways．A high concentration of radioactivity appeared in the gill filaments throughout the exposure period(24,h)，and the concentration gradually decreased when fish were put in clean water for depuration．A selective labelling of the olfactory organ was also observed．The uptake of radioactivity in the kidney and liver was pronounced but lower than in the gills．The overall distribution pattern of14,C-indigo was similar in fish exposed to the vehicle(DMSO)and in fish exposed to the CYP1 inducer，PCB126．The accumulation of14,C-indigo in the gills was，however completely blocked in PCB 126-exposed fish exposed to the CYP1 inhibitor ellipticine.

indigo；autoradiography；rainbow trout

X171.5

A

1006-8945(2015)09-0083-04

*通讯作者

天津市应用基础与前沿技术研究计划(合同编号：14JCYBJC43800)。

2015-08-02