左归丸和巴氯芬联用对脑瘫鼠运动认知的影响

李 玲，焦银香，张 菡，李 静，李红霞

(1.陕西省康复医院，陕西 西安710061；2.未央区张家堡社区健康服务中心，陕西 西安710021；3.西安交通大学药学院，陕西 西安710061)

左归丸和巴氯芬联用对脑瘫鼠运动认知的影响

李 玲1，焦银香2，张 菡3，李 静3，李红霞1

(1.陕西省康复医院，陕西 西安710061；2.未央区张家堡社区健康服务中心，陕西 西安710021；3.西安交通大学药学院，陕西 西安710061)

目的 探讨左归丸和巴氯芬联用对新生脑瘫大鼠运动协调能力和认知能力的影响，并研究其可能的机制。方法 随机将SD大鼠分为假手术组、脑瘫(CP)模型未给药组、CP模型左归丸组、CP模型巴氯芬组以及CP模型左归丸+巴氯芬联用组。分别于药物处理前，处理7、14、21、28天及治疗结束后7天时分别测定各组大鼠神经行为学指标，治疗结束后7天后测定血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)，一氧化氮合酶(NOS)和脑组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的变化。结果 巴氯芬治疗组和联用组在服药14天后与同期CP模型未给药组比较肌张力显著降低(t值分别为4.603、5.590，均P<0.05)，通过平衡木时间缩短(t值分别为6.337、5.575，均P<0.05)；而左归丸组于治疗28天后，大鼠通过平衡木时间才显著缩短(t=6.124，P<0.05)。左归丸治疗组和联用组大鼠服药28天后学习记忆能力较CP模型未给药组明显改善(t值分别为-4.314、-5.314，均P<0.05)；联用组效果优于左归丸组(t=-2346，P<0.05)；而巴氯芬处理组大鼠则无明显变化(t=-2.025，P>0.05)。与CP模型未给药组相比，左归丸组以及联用组大鼠的TNF-α、NOS和MDA显著降低，SOD显著升高，同时神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA和蛋白水平升高(左归丸组：t值分别为2.456、4.898、5.803、-6.144，-4.224、-5.124、-3.272、-4.166；联用组：t值分别为2.833、5.009、9.078、-6.056，-7.439、-7.142、-5.812、-4.301；均P<0.05)，联用组的作用比左归丸组更强(t值分别为2.613、3.241、2.624、-3.194、-3.275、-4.002、-3.986、-2.881，均P<0.05)，而巴氯芬组上述指标无明显变化(P>0.05)。结论 左归丸和巴氯芬联用与单独用药相比能明显改善大鼠运动，且有可能通过保护神经细胞，促进神经元的修复来改善其认知功能。

左归丸；巴氯芬；联用；小儿脑瘫；动物模型

小儿脑性瘫痪(简称脑瘫，cerebral palsy，CP)是指发生于受孕期至婴儿期的一种非进行性脑损伤和发育缺陷所导致的综合征，主要表现为姿势异常与运动障碍，并发不同程度智力障碍、癫痫、感知和交流障碍以及其他异常。据报道，我国小儿脑瘫的患病率约为1.8～6.0‰，因此脑瘫是当今导致儿童残疾的主要原因之一。脑瘫的发病机制复杂，是多因素综合作用的结果，高危因素中以早产、窒息、核黄疸为主[1]。

脑瘫常用的治疗方法主要是中西医药物、手术治疗、中医针灸按摩和康复训练等多种手段相结合的综合治疗方法[2]。尽管脑瘫的治疗已取得很大的进步，但目前的治疗仅限于对症支持，缺乏特效治疗。巴氯芬为氨基丁酸激动剂，可抑制异常的单突触伸肌活动和多突触的屈肌活动，降低肌张力，还可抑制兴奋神经递质的释放，弱化疼痛感受，从而改善脑瘫症状，但临床上巴氯芬口服吸收效率差，而鞘内注射则会导致脑脊液漏和感染等并发症发生率升高，且停药后易反弹[3]。左归丸方源自《景岳全书》，为真阴不足精髓内亏所致诸证而设，具有补肾益髓之功效。研究表明左归丸可能通过调节氨基酸类神经递质受体表达，改善神经内分泌稳态[4]。本文将应用单侧颈总动脉结扎结合缺氧的方法建立新生脑瘫大鼠动物模型，研究左归丸、巴氯芬以及二者联用对脑瘫大鼠神经运动学行为以及学习记忆能力的影响，并进一步探讨其作用机制。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物和药品及试剂

7日龄新生清洁级SD大鼠(12～15g)，由第四军医大学实验动物中心提供。

巴氯芬，10mg/片。左归丸(组成：熟地黄、菟丝子、牛膝、龟甲胶、鹿角胶、山药、山茱萸、枸杞子)国药准字：Z41020696，使用前用生理盐水配制成相应浓度的溶液。肿瘤坏死因子(TNF-α)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)，ELISA试剂盒(南京建成生物研究所)；神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)抗体(美国Santa Cruz)。

1.2 脑瘫大鼠模型建立

7日龄SD新生鼠注射三氟溴氯乙烷麻醉后取仰卧位固定在木板上，75%酒精消毒皮肤，行颈部正中切口，分离皮下脂肪，血管钳分离出左颈总动脉，并用7号灭菌丝线双线结扎并剪断血管，术中用明胶海绵止血，缝合伤口并再次消毒皮肤，整个手术过程在10分钟内完成。而后37℃水浴箱复温，回笼休息2～4小时，放入37℃恒温的密闭缺氧箱内，向缺氧箱内通含8%氧气和92%氮气的混合气体(气流量0.5L/min，温度为37℃，湿度为70%±5%)，低氧处理2h后取出，继续保温1h。实验结束后，放回鼠笼由母鼠行母乳喂养。

实验动物分组及给药：将实验大鼠随机分为5组，即假手术组、CP模型未给药组、巴氯芬组、左归丸组以及巴氯芬和左归丸联用组，每组动物10只。假手术组大鼠仅予以分离左颈总动脉，不予结扎和缺氧处理，其他组大鼠均行单侧颈总动脉结扎手术并结合缺氧处理。假手术组和CP模型未给药组：正常喂养，灌胃同体积生理盐水；左归丸组：左归丸3g·kg-1·d-1灌胃；巴氯芬组：10mg·kg-1·d-1灌胃；左归丸+巴氯芬组：左归丸3g·kg-1·d-1+巴氯芬10mg·kg-1·d-1灌胃。造模成功后第1天起连续灌胃4周。

1.3 肌张力测定

各组大鼠分别于治疗前、治疗7、14、21和28天后对后肢肌张力进行测定。将电刺激针插入后肢股四头肌内，一端连接于WQ9E痛阈测量仪。在大鼠后肢下端系一丝线，丝线经传感器与LMS-2A 型生理记录仪相连接，定时对股四头肌进行刺激通过记录仪记录后肢伸直的幅度，并均以双侧后肢分别进行评定分级，每只大鼠的肌张力分级为双侧分级的均值。

1.4 平衡木行走试验

分别于治疗前、服药7，14，21，28天分别应用平衡木行走实验对大鼠运动整合及协调能力进行评价[5]。平衡木宽1.5cm，长100cm，平放在距离地面50cm高处，两端分别连接长12.5cm方形平台，其中一端放置25cm×25cm×20.5cm开口向平衡木的黑色箱子。大鼠向箱子处行走以逃避外界噪音干扰，用秒表记录大鼠通过100cm平衡木所需的时间。

1.5 Y迷宫试验

Y迷宫试验参照徐秉炬的方法进行[6]。结果记录20次反应中的正确反应次数。测试分别于治疗前、服药14、21和28天时以及停药后7天进行。

1.6 逆转录-聚合酶链反应

末次给药处理后第7天，每组任取5只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉，中性福尔马林溶液心脏灌流牺牲动物，取脑组织匀浆低温离心。采用RNA iso plus kit试剂盒提取组织总RNA，按照试剂盒要求操作。引物序列：NGF：5'-CTG GAC CCA AGC TCA CCT CA-3'(sense)，5'-GTG GAT GAG CGC TTG CTC G -3' (antisense)；BDNFL：5'-CTG ACC AGT TTG ATG ACG TC-3' (sense)，5'-TCT AAA AAC GAC AGG TCG TC-3'(antisense)；β-actin，5'-CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3'(sense)，5'-CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3' (antisense)。按实验室常规方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增。反应条件为：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，30个循环后，72℃延伸5分钟。以β-actin为内参，计算各样本NGF和BDNF的mRNA的相对表达量。

1.7 蛋白质印迹法

末次给药处理后第7天，取各组大鼠脑组织加裂解液进行匀浆，离心后取上清，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。制备10%聚丙烯酰胺凝胶，冰浴进行电泳，电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉4℃封闭2小时后加5%脱脂奶粉稀释好的一抗，室温反应60分钟；用TBST缓冲液洗膜10分钟×3次；加入辣根过氧化物酶标记的NGF、BDNF二抗室温孵育2小时。洗膜后ECL发光，X-光片显影、定影、扫描仪扫描胶片。采用Image-ProPlus 6.0软件对NGF和BDNF蛋白条带进行定量分析，以β-actin作为内参。

1.8 酶联免疫吸附反应

末次给药处理后第7天，分别取各组大鼠血清和脑组织，利用酶联免疫吸附反应(ELISA)法测定各组大鼠血清中TNF-α，NOS以及脑组织中MDA、SOD的含量，具体步骤按说明书进行。

1.9 统计学方法

以SPSS 12.0统计分析软件进行统计，采用t检验分析，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 左归丸与巴氯芬联用对脑瘫大鼠肌张力及后肢运动功能的影响

为了评价左归丸与巴氯芬联用对脑瘫大鼠运动能力的改善作用，本研究分别测定了治疗前以及治疗28天内不同时间点各组大鼠后肢肌张力等级与运动能力，结果显示，与假手术组大鼠相比，CP模型未给药组大鼠肌张力等级显著升高(t=-26.67，P<0.05)。与治疗前和同期CP模型未给药组相比，左归丸治疗组大鼠在灌胃服药28天之后肌张力明显降低(t值分别为4.365和3.825，均P<0.05)。而巴氯芬治疗组以及联用组大鼠在药物处理14天后肌张力均显著下降(与治疗前比，t值分别为4.563和3.986；与同期CP模型比，t值分别为4.603和5.590；均P<0.05),见表1。另外，在平衡木行走试验中，CP模型未给药组大鼠通过平衡木的时间显著增加(t=-11.997，P<0.05)，而巴氯芬单用组以及联用组可在14天后显著缩短大鼠通过平衡木的时间(t值分别为6.337和5.575，P<0.05)，且联用组效果优于巴氯芬单用组，而左归丸组于治疗28天后，大鼠通过平衡木时间显著缩短(t=6.124，P<0.05)，见图1。

表1 各组大鼠治疗前和治疗后肌张力评级

注：与治疗前相比*P<0.05；与同期模型组比较#P<0.05。

图1 各组大鼠不同时间点通过平衡木所用时间

Fig.1 The time used to get through the balance for rats of different groups at different time point

2.2 左归丸与巴氯芬联用对大鼠学习记忆能力的影响

分别于治疗前、服药28天内不同时间点以及停药后7天测定各组大鼠Y迷宫试验正确反应次数，结果显示，模型未给药组大鼠反应次数于同期假手术组相比显著下降(t=9.375，P<0.05)。左归丸治疗组大鼠在服药21天后，反应次数较治疗前显著升高(t=-3.652，P<0.05)；28天后显著高于同期CP模型未给药组(t=-4.314，P<0.05)；且停药7天后，疗效仍可维持。巴氯芬治疗组大鼠则在治疗前后反应次数无明显变化(t=-2.025，P>0.05)，同时，巴氯芬与左归丸联用组大鼠也在治疗21天后较治疗前学习记忆能力显著改善(t=-2.303，P<0.05)，并且改善效果略优左归丸单用(t=-2346，P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠治疗前和治疗后Y迷宫正确反应次数变化

2.3 左归丸与巴氯芬联用对大鼠组织细胞因子和氧化应激水平的影响

利用ELISA法分别测定各组大鼠血清中TNF-α和NOS以及脑组织中SOD和MDA的水平变化。结果显示，CP模型未给药组大鼠血清中TNF-α、NOS以及脑组织MDA含量显著高于假手术组，SOD含量显著下降(t值分别为-4.628、-8.874、-8.227和9.005，均P<0.05)；与模型组相比，左归丸单用组和左归丸与巴氯芬联用组可显著降低TNF-α、NOS和MDA的水平，同时促进SOD含量增加(左归丸单用组，t值分别为2.456、4.898、5.803和-6.144；联用组，t值分别为2.833、5.009、9.078和-6.056；均P<0.05)；而巴氯芬治疗组与CP模型未给药组相比各因子水平无显著性差异(t值分别为1.978、-0.082、-2.083和2.164，均P>0.05)；左归丸与巴氯芬联用效果优于单用左归丸(t值分别为-2.613、-3.241、-2.624、-3.194，均P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠细胞因子和氧化应激水平的变化

注：与假手术组相比*P<0.05；与模型组比较#P<0.05。

2.4 左归丸与巴氯芬联用对大鼠脑组织神经生长因子和脑源性神经营养因子表达的影响

分别利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blotting)检测各组大鼠脑组织中NGF和BDNF分别在基因转录水平(mRNA水平)和蛋白表达水平的变化，结果显示，CP模型未给药组大鼠脑组织NGF和BDNF的mRNA和蛋白水平较假手术组均明显降低(t值分别为10.071、10.216，6.942、7.746，均P<0.05)，左归丸单用组及联用组则显著促进了脑瘫大鼠NGF和BDNF的转录和表达(左归丸组NGF和BDNF的基因转录水平：t值分别为-4.224、-5.124，NGF和BDNF的蛋白表达水平t值分别为-3.272、-4.166；联用组NGF和BDNF的基因转录水平：t值分别为-7.439、-7.142，NGF和BDNF的蛋白表达水平：t值分别为-5.812、-4.301；均P<0.05)，而巴氯芬组则对脑瘫大鼠脑组织中NGF和BDNF的转录和表达水平无明显影响(NGF和BDNF的基因转录水平：t值分别为-2.014、-1.955，NGF和BDNF的蛋白表达水平：-1.749、-1.022；均P>0.05)；与左归丸组单用组比，联用组更能促进二者的表达，见图2。

A：NGF和BDNF的mRNA水平；B：NGF和BDNF的表达水平

A: MRNA levels of NGF and BDNF; B: Expression levels of NGF and BDNF

1：假手术组；2：CP模型未给药组；3：左归丸治疗组；4：巴氯芬治疗组；5：左归丸+巴氯芬治疗组

1:Sham-operated group, 2: CP model without treatment group, 3:Zuoguiwan group, 4: Baclofen group, 5: Zuoguiwan combined with Baclofen group

注：与假手术组相比*P<0.05；与CP模型未给药组比较#P<0.05。

图2 各组大鼠脑组织中NGF和BDNF的mRNA和蛋白表达水平

Fig.2 MRNA and protein expression levels of NGF and BDNF in brain tissue of different rat groups

3 讨论

3.1 药物联用对脑瘫大鼠运动功能的改善

脑瘫是幼儿残疾病中最严重病因之一，由于环境污染、高龄产妇增多等原因，脑瘫的发病率呈现上升趋势。本文中，与假手术组大鼠相比，CP模型未给药组大鼠肌张力等级显著升高，通过平衡木的时间显著增加，Y迷宫试验正确反应次数显著下降，提示建立的动物模型符合脑瘫的基本特征，可用于后续研究。

在改善新生脑瘫大鼠运动功能方面，左归丸可以改善运动功能，但起效时间较晚；而巴氯芬和巴氯芬与左归丸联用显效时间均较短，而且联用治疗效果较单用巴氯芬好，提示巴氯芬对于改善脑瘫大鼠运动功能效果较好，左归丸具有增强巴氯芬治疗效果的作用。

3.2 药物联用可降低脑组织氧化应激水平

在CP的发病过程中，存在于脑组织中的细胞因子及其受体对中枢神经系统的多项生理功能均具有调控作用。NOS是专一催化NO生物合成的酶，所以体内NO的生物作用完全依赖于NOS。NO氧化产物的大量生成可引起强烈的神经毒性，进而引起神经细胞损伤。TNF-α是免疫-神经-内分泌网络调节的主要分子之一，过度的TNF-α表现出明显的神经细胞毒性。MDA水平的变化反映了脑组织自由基的水平和脂质过氧化的程度，同时也反映了神经细胞的受损程度[7]。本实验结果表明左归丸治疗组和联用组大鼠在治疗21天后学习记忆能力显著改善，同时两组TNF-α、NOS和MDA的水平显著降低，SOD含量增加，并且联用组效果优于左归丸组。因此，推测左归丸通过抑制细胞因子NOS和TNF-α的生成，保护神经细胞，进而降低脑组织氧化应激性水平；且在药物联用的治疗作用上，左归丸发挥主要作用，巴氯芬具有增强疗效的作用。

3.3 药物联用可促进神经元修复

NGF可诱导突触生长，刺激胞体增大和促进树突发育，促进蛋白合成，并促进受损的中枢神经纤维长出新的轴突，使其可直接到达原来的靶细胞处，建立新的突触联系。BDNF可以下调N-甲基-D-天冬氨酸受体功能，抵抗兴奋性氨基酸的毒性，减轻自由基对神经元的损伤[8]。实验结果显示，左归丸单用组以及联用组显著促进了脑瘫大鼠NGF和BDNF的转录和表达，且联用的效果更好，提示药物通过促进脑组织中NGF和BDNF的合成和分泌，削弱神经元的损伤并促进神经元的修复，从而改善大鼠学习记忆能力。

本文通过建立CP大鼠模型探究左归丸和巴氯芬对新生大鼠脑瘫的治疗作用，表明左归丸具有神经保护作用，巴氯芬高效改善运动功能，左归丸和巴氯芬联用能改善大鼠运动功能，同时可能通过保护神经细胞，促进神经元的修复以改善其认知功能。因此，本研究将为脑瘫患者的治疗提供新的研究方向。

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[专业责任编辑：史晓薇]

Effect of combined application of Zuoguiwan and Baclofen on motor and cognition of rats with cerebral palsy

LI Ling1, JIAO Yin-xiang2, ZHANG Han3, LI Jing3, LI Hong-xia1

(1.ShaanxiRehabilitationHospital,ShaanxiXi’an710061,China;
2.WeiyangDistrictZhangjiabuCommunityHealthServiceCenter,ShaanxiXi’an710021,China;
3.PharmacyCollege,Xi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To investigate the effect of the combined application of Zuoguiwan and Baclofen on motor coordination ability and cognitive function of newborn rats with cerebral palsy (CP) and to study its possible mechanism. Methods SD rats were randomly divided into sham-operated group, CP model without treatment group, CP model with Zuoguiwan group, CP model with Baclofen group, and CP model with Zuoguiwan combined with Baclofen group. Neurobehavioral indexes were detected in each group before treatment, 7, 14, 21 and 28 day treatment, and 7 day after treatment, respectively. TNF-α and NOS in serum, and MDA and SOD in brain tissue of rats were measured in each group 7 day after treatment. Results Compared with CP model without treatment group, muscle tension reduced significantly and the time of going through the balance reduced in Baclofen group and Zuoguiwan combined with Baclofen group after having taken the drugs for 14 days (tvalue was 4.603, 5.590, 6.337 and 5.575, respectively, allP<0.05). While Zuoguiwan group shortened the time to go through the balance after 28 day treatment (t=6.124,P<0.05). Compared with CP model without treatment group, the contents of TNF-α, NOS and MDA declined significantly but the levels of SOD, NGF and mRNA rose remarkably (tZuoguiwan groupvalue was 2.456, 4.898, 5.803, -6.144, -4.224, -5.124, -3.272 and -4.166, respectively,tcombined groupvalue was 2.833, 5.009, 9.078, -6.056, -7.439, -7.142, -5.812 and -4.301, respectively, allP<0.05). The efficacy of the combined group was greater than Zuoguiwan group (tvalue was 2.613, 3.241, 2.624, -3.194, -3.275, -4.002, -3.986 and -2.881, respectively, allP<0.05). However, there was no obvious change in Baclofen group (P>0.05). Conclusion Compared with single drug therapy, combined application of Zuoguiwan and Baclofen can improve motor more obviously, and it may improve the cognition function of rats by protecting neurocyte and repairing neuron.

Zuoguiwan；Baclofen;combined application;infant cerebral palsy;rat model

2014-06-12

李 玲(1978-)，女，主治医师，主要从事儿童康复方面的工作。

李红霞，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015. 02.015

R715.3

A

1673-5293(2015)02-0210-04