有机阴离子转运多肽1B1基因多态性和利福平血药浓度对肝毒性的影响

邓国防 孙丽珍 詹森林 李巍 吴于青 邓群 雷建平 余少良



·论著·

有机阴离子转运多肽1B1基因多态性和利福平血药浓度对肝毒性的影响

邓国防 孙丽珍 詹森林 李巍 吴于青 邓群 雷建平 余少良

目的 观察有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1，又称编码基因SLCO1B1)A388G基因多态性和利福平血药浓度对肝脏毒性的影响。方法 选择2013年9月至2014年3月来自深圳市第三人民医院住院或门诊接受治疗的汉族患者，服用含利福平药物肝功能异常的肺结核患者(简称“异常组”)和服用含利福平药物肝功能正常的肺结核患者(简称“正常组”)各30例，其中正常组：男19例，女11例，平均年龄(37.70±11.78)岁；异常组：男21例，女9例，平均年龄(38.60±11.56)岁。分别进行OATP1B1A388G基因分型和利福平血药浓度检测，使用GraphPad Prism 5进行统计学处理，采用χ2检验比较正常组与异常组的等位基因频率差异，以t检验比较正常组与异常组利福平血药浓度差异，P<0.05作为差异有统计学意义。结果 正常组患者OATP1B1A388G基因rs2306283位点基因频率分布A：36.7% (22/60)，G：63.3% (38/60)，异常组A：23.3% (14/60)，G：76.7% (46/60)，差异无统计学意义(χ2=2.54，P>0.05)；正常组患者利福平血药浓度检测结果为(69.36±28.85) mg/L，异常组为(33.20±19.88) mg/L，差异有统计学意义(t=13.16，P<0.05)。结论 OATP1B1A388G基因多态性分布与服用含利福平药物的肝毒性无明显相关，而利福平血药浓度与肝毒性呈明显相关，应加强对利福平血药浓度监测，降低患者肝毒性。

有机阴离子转运子； 多态性,单核苷酸； 利福平； 血药浓度； 药物性肝损伤

有机阴离子转运多肽1B1(organic anion transporting polypeptide，OATP1B1)是肝脏重要转运蛋白之一，它能从血液中摄取多种物质进入肝细胞[1]。作为一种重要的肝脏摄取转运体，参与多种内源性物质及利福平、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)抑制剂、内皮素受体拮抗剂环五肽BQ123(-D-Asp-L-Pro-D Val L-Leu-D Trp-)等药物的转运[2]。有研究表明，OATP1B1存在遗传多态性，具有某些等位基因的OATP1B1的转运能力降低，会对多种药物的药物代谢动力学(简称“药代动力学”)及药物效应动力学(简称“药效学”)过程产生影响，OATP1B1基因多态性与药物的不良反应及药物相互作用有关[3-4]。利福平是常用的一线抗结核药物，具有较大的肝细胞毒性，联合异烟肼和吡嗪酰胺等药物抗结核治疗，约40.4%引起肝损伤，肝功能损伤出现时间多数为用药后1～3个月[5]。利福平作为OATP1B1的特异性底物，主要通过肝细胞膜表面OATP1B1转运进入肝细胞内[6-7]。那么，是否利福平肝毒性与OATP1B1介导的肝脏中利福平药物浓度密切相关？为阐述OATP1B1(又称“编码基因SLCO1B1”)A388G基因多态性、利福平血药浓度及肝毒性之间的相关性，本研究对这一问题进行了探讨。

材料和方法

一、材料

1.纳入标准：初治肺结核患者，均为发病期间在深圳市第三人民医院住院或门诊接受治疗的患者；抗结核方案为：2HRZE/4HR。入组时肝功能均正常。既往无肝炎发作史，并排除病毒性肝炎、肝结核、酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫其他感染性疾病等，抗结核治疗前1个月及治疗过程中未服用其他损伤肝脏的药物。本研究经医院伦理委员会批准，所有入组研究对象均签署知情同意书。

2.患者资料和分组：收集2013年9月至2014年3月来自深圳市第三人民医院住院或门诊接受治疗的汉族患者共60例。患者在抗结核治疗中肝功能保持正常者为正常组，在抗结核治疗中出现肝功能异常者为异常组。肝功能正常患者30例，其中男19例，女11例，平均年龄(37.70±11.78)岁。肝功能异常患者30例，其中男21例，女9例，平均年龄(38.60±11.56)岁。正常组与异常组的性别、年龄差异均无统计学意义(χ2=0.30，P>0.05；F=0.13，P>0.05)。

3.诊断标准：初治肺结核患者的诊断均符合2001年中华医学会结核病学分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》的诊断标准[8]；药物性肝损伤的诊断按照Roussel Uclaf因果关系评价法(the Roussel Uclaf causality assessment method，RUCAM)的诊断标准[9]。

4.仪器、试剂与药品：全血DNA抽提试剂盒(QIAamp DNA blood mini kit)购自德国Qiagen公司，等位基因分型试剂购自美国ABI公司，Nanodrop紫外分光光度计为美国Agilent公司产品，7500实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品，其他实验耗材购自Axygen公司。Agilent 1100 高效液相色谱仪，包括DE14918851型四元泵、DE14919131型自动进样器、JP2017368型紫外检测器、DE14927936型柱温控制箱、Sorvall Pico型高速离心机、MSl Minishaker型振荡器(德国Mandel 科学公司产品)，G&G型电子天平、BP221S型1/10 000分析天平(最大值=220 g)、津腾GM-1.00隔膜真空泵、利福平标准品(编号130496)均购自中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯)：德国Merck公司，色谱纯，批号为1719107349；甲酸(分析纯)：西陇化工股份有限公司，分析纯，批号为120428-I。

二、方法

(一)基因分型

1. 提取基因组DNA：采集肝素锂抗凝的外周血2.0 ml，使用全血DNA抽提试剂盒获取基因组DNA，操作按照说明书进行。取DNA样本2 μl，用紫外分光光度计测定DNA纯度和浓度，提取出DNA后置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.rs2306283位点引物设计：采用7500实时荧光定量PCR仪随机软件Primer Express 3.0进行引物和探针的设计。针对rs2306283位点等位基因设计2条探针，分别采用VIC[绿色荧光蛋白(GFP)最初是从维多利亚多管发光水母(学名：Aequoreavictoria)中分离出来的结构蛋白，故简称“VIC”]和羧基荧光素(FAM)进行荧光标记。所有引物均由上海Invitrogen公司合成。

3.rs2306283位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymophism，SNP)分型：逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，反应体系为10 μl，其中包含2×TaqMan等位基因分型Mix 5 μl，40×引物探针混合液0.25 μl，DNA 2 μl，ddH2O 2.75 μl。RT-PCR反应程序为：扩增条件95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。

4. 实验结果判定：rs2306283 SNP位点的两个等位基因A和G的探针分别采用VIC和FAM荧光素进行标记。样本为等位基因A的纯合子时，PCR扩增过程中仅能检测到VIC荧光；样本为等位基因G的纯合子时，PCR扩增过程中仅能检测到FAM荧光；样本为杂合子时，PCR扩增过程中可同时检测到FAM和VIC两种荧光。

(二)血药浓度检测

1. 色谱条件：采用液相色谱柱(热电公司Thermo集团；4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相：0.5 mmol磷酸二氢铵溶液-甲醇(磷酸二氢铵溶液∶甲醇=25∶75)，pH=6.1；柱温：25 ℃；流率: 1.3 ml/min；检测波长: 340 nm。

2. 标准溶液配制：精密称取利福平对照品20 mg置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，质量浓度为2 g/L的标准储备液，冷藏保存。

3. 血浆样品处理：取血浆样本0.2 ml，置1.5 ml离心管中，加入0.4 ml甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡30 s；2000×g离心10 min，吸取上清液20 μl进样。

三、统计学处理

实验数据统计分析由GraphPad Prism 5软件统计完成，采用χ2检验比较正常组与异常组的等位基因频率差异，进一步计算各等位基因与肝毒性发生的比值比(OR值)和95%可信区间(95%CI)。采用t检验比较正常组与异常组利福平血药浓度差异，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、OATP1B1A388G等位基因(rs2306283)位点TaqMan分型结果

TaqMan技术可以对OATP1B1A388G基因rs2306283位点进行有效等位基因分型，该位点具有A和G两种等位基因，包括AA型、AG型和GG型共3种基因型。

二、两组OATP1B1A388G基因rs2306283位点等位基因频率的比较：正常组A、G等位基因频率分别为 36.7%(22/60)、66.3%(38/60)，异常组A、G等位基因频率分别为23.3%(14/60)、76.7%(46/60)，在两组人群中差异无统计学意义(χ2=2.54，P>0.05)(表1)。

三、 正常组和异常组RFP血药浓度比较

结果显示，正常组患者利福平血药浓度检测为(69.36±28.85) mg/L，异常组(33.20±19.88) mg/L，差异有统计学意义(t=13.16，P<0.05)。

讨 论

OATP1B1是最重要的胆汁酸转运体之一。它主要表达于人肝细胞膜基底外侧，负责胆红素的吸收[10]。最近研究表明，利福平的肝毒性机制是干扰胆红素和葡萄糖醛酸结合及排泄从而升高血清胆红素所致[11]，尤其是胆汁酸转运体的基因多态性与利福平的肝毒性密切相关[12]。

一、OATP1B1A388G位点等位基因表达与利福平肝毒性相关性

已证实OATP1B1A388G存在基因多态性，本研究的检测数据显示，在同汉族人种家族中，利福平肝毒性与OATP1B1A388G基因位点等位基因多态性无明显相关性，这和Li 等[13]的报道相似。有文献报道，在亚组分析中，单体型与胆汁淤积型或混合型肝损伤密切相关(P=0.03，OR=2.31，95%CI=1.06～5.02)。结果表明：单体型是利福平诱导肝损伤的一个很重要的因素[11]。李灵敏等[14]报道，OATP1B1A388G基因位点与抗结核药物肝损伤无相关性，OATP1B1T521C基因位点与抗结核药物肝损伤存在相关性，其可能成为抗结核药肝损伤风险预测的候选基因。但是否还存在其他OATP1B1位点等位基因表达，需要进一步研究。

表1 两组患者rs2306283位点等位基因频率、基因型分布的结果分析

二、利福平血药浓度与肝毒性相关性

利福平作为OATP1B1的特异性底物，主要通过肝细胞膜表面OATP1B1转运进入肝细胞内。有报道，若无肝脏基础疾病时，利福平血药浓度低，肝毒性大，血药浓度高，肝毒性小[15]。而本研究检测结果也证实了这一结论。提示利福平肝毒性与OATP1B1介导的肝脏中利福平药物浓度有密切关系，对评估患者利福平潜在肝毒性可能有一定的临床预警作用。推测产生这种现象原因可能为OATP1B1A388G基因突变导致OATP1B1对利福平的摄取转运能力减弱，利福平经OATP1B1摄取进入肝脏的量相对较少，致使利福平的血药浓度相对增加，肝毒性发生率相对降低。相反，未发生突变患者OATP1B1对利福平的摄取转运能力较强，利福平经OATP1B1摄取进入肝脏的量相对较多，致使利福平的血药浓度相对减少，肝毒性发生率相对增高。今后应进行这方面的研究和关注，以进一步解释此结论。

三、利福平血药浓度检测的意义

利福平血药浓度检测为临床利福平的有效合理应用和药物不良反应时的监测提供了参考依据，对临床治疗具有指导意义。笔者认为，若无肝脏基础疾病且肝功能在正常范围内，依据利福平血药浓度水平可指导临床对患者给药剂量个体化，以达到最佳治疗效果。有因抗结核药物浓度不足导致治疗失败甚至产生耐药的文献报道。因此，进行利福平治疗药物监测是优化患者实施个体化治疗的重要策略[16]。当服药后患者肝功能出现异常，若检测出利福平血药浓度低，提示利福平所致肝毒性可能性大，建议减少利福平使用剂量或停用，以免肝损伤继续加重；若检测出利福平血药浓度高，提示非利福平药物所致肝毒性可能性大，建议减少非利福平药物使用剂量或停用，以免肝损伤继续加重。当服药后患者肝功能正常，若检测出利福平血药浓度低，则提示利福平使用剂量不足，应加大治疗剂量；若检测出利福平血药浓度高，则提示利福平使用剂量充足。

显然，按常规剂量给药时，由于年龄、肝脏疾病、不同厂家不同批号的药物生物利用度不同等多种因素都能影响血药浓度，故对服用利福平的患者进行血药浓度监测，则可根据监测结果调整给药剂量，既减少肝毒性，又保证血药浓度，从而提高结核病的治愈率，减少复发率，降低抗结核药物的不良反应[17]。然而，目前国内并没有要求对利福平常规进行TDM，主要原因是很多医院及防治机构缺乏检测TDM相关设备和专业人员、检测流程繁琐而且没有标准化、专业跨学科等，制约了TDM技术的广泛开展和应用。

由于本研究样本数量偏少，实验方法及设计存在不足之处。OATP1B1A388G基因多态性、利福平血药浓度与患者肝毒性、临床疗效的相关性仍需深入地进行临床大样本对照研究，应进一步加强OATP1B1A388G基因突变和521T1C位点的研究及检测，为指导临床应用利福平个体化提供依据。

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(本文编辑：王然 薛爱华)

中国防痨协会第十一届理事会名单(2015年)

理 事 长 刘剑君

副理事长 许绍发 洪 峰 王黎霞 王栩冬 张宗德 钟 球 袁政安

秘 书 长 成诗明

常务理事 (按姓氏笔划为序)万利亚 马永成 王 毳 王卫华 王国治 王栩冬 王晓萌 王新伦 王黎霞 尹秋莲 白丽琼 成诗明 邢 进 刘飞鹰 刘剑君 许绍发 李发斌 杨应周 肖和平 吴红辉 吴建林 邱林西 何 健 张 娟 张 雷 张山鹰 张广宇 张天华 张宗德 陈日华 易 星 金 奇 赵雁林 查 舜 钟 球 胡代玉 洪 峰 姚 嵩 贺晓新 袁政安 袁燕莉 顾 清 徐 飚 高大川 高方方 蒋仁生 曹国希 曹继平 傅衍勇

理事名单 (按姓氏笔划为序)刁琳琪 于景来 万利亚 马永成 王 琳 王 毳 王卫华 王仲元 王国治 王春花 王春雷 王桂林 王栩冬 王晓林 王晓萌 王甦民 王新伦 王黎霞 尹秋莲 邓 平 邓海巨 叶建君 付春生 白丽琼 兰克涛 邢 进 达 瓦 成诗明 毕利军 朱磷扬 任育麟 刘 勇 刘 晖 刘 新 刘飞鹰 刘风林 刘存旭 刘剑君 刘晓清 刘锦程 刘新文 闫兴录 许绍发 纪滨英 严晓峰 杜昌廷 李 琦 李 锋 李 震 李长裕 李月华 李发斌 李尚伦 李树民 李登瑞 杨应周 杨 文 杨枢敏 杨国儒 肖和平 肖宝荣 肖艳文 吴红辉 吴建林 吴琍敏 吴雪琼 邱林西 何 健 邹 铮 沈 鑫 初乃惠 张 青 张 娟 张 雷 张 慧 张山鹰 张广宇 张天华 张文龙 张国龙 张佩如 张宗德 张铁娟 张联英 陆 伟 陆敬儒 陈日华 陈明亭 陈根旺 邵世峰 范月玲 范为民 范永德 林 玫 林淑芳 卓 玛 易 星 金 奇 周 杰 周 琳 周继如 郑蓉蓉 赵雁林 胡 林 胡代玉 查 舜 钟 球 侯双翼 饶 英 施军卫 姜洪波 洪 峰 姚 嵩 姚荣卫 贺晓新 袁政安 袁燕莉 顾 清 顾晓明 徐 飚 高大川 高方方 高孟秋 高铁杰 唐细良 唐晓勇 蒲 江 梅 建 曹文利 曹国希 曹继平 崔颖杰 彭东东 董红军 蒋仁生 蒋健敏 傅衍勇 雷世光 鲍务新 蔺 刚 鲜小萍 谭守勇 熊昌富 薛爱华 戴宪法

Effects of organic anion transporting polypeptide 1B1 polymorphism and plasma concentration of rifampicin on liver injury

DENGGuo-fang,SUNLi-zhen,ZHANSen-lin,LIWei,WUYu-qing,DENGQun,LEIJian-ping,YUShao-liang.
PulmonaryDepartmentTwo,ShenzhenThirdPeople’sHospital,Shenzhen518112,China.

SUNLi-zhen,Email：slz0311@yeah.net

Objective To observe the effects of organic anion transporting polypeptide 1B1 (OATP1B1, encoded by SLCO1B1)A388Gpolymorphism and the plasma concentration of rifampicin on drug (rifampicin)-induced liver injury. Methods Thirty pulmonary tuberculosis patients with drug (rifampicin)-induced liver injury (abnormal group), and 30 pulmonary tuberculosis patients without drug (rifampicin)-induced liver injury (normal group) treated with antituberculous regimen containing rifampicin were recruited from the third people’s Hospital of Shenzhen inpatients or outpatients of Han nationality from September 2013 to March 2014. In the normal group, there were 19 males and 11 females, with average age (37.70±11.78) years. In the abnormal group, 21 males and 9 females, with average age (38.60±11.56) years. TaqMan probe was designed and real-time PCR was used to detect OATP1B1A388Ggenotype polymorphism. The plasma concentration of rifampicin was detected by high perfor-mance liquid chromatography (HPLC)．Using GraphPad Prism 5 software for statistical analysis. Usingχ2test compared allelic gene frequency difference and usingt-test compared rifampicin blood drug concentration difference between the normal group and abnormal group.P<0.05 was considered statistically significant. Results OATP1B1A388Ggenotypes existed allele frequency A：36.7% (22/60)，G：63.3% (38/60) in normal group and A：23.3% (14/60)，G：76.7% (46/60) in abnormal group. The difference was not statistically significant between abnormal group and normal group(χ2=2.54，P>0.05). The plasma concentration of rifampicin was (69.36±28.85) mg/L in normal group,(33.20±19.88) mg/L in abnormal group, the difference was statistically significant (t=13.16，P<0.05). Conclusion OATP1B1A388Ggene polymorphism is not associated with drug (rifampicin)-induced liver injury, and the plasma concentration of rifampicin is significantly associated with drug (rifampicin)-induced liver injury. In order to reduce drug (rifampicin)-induced liver injury, the plasma concentration of rifampicin should be monitored.

Organic anion transporters； Polymorphism,single nucleotide； Rifampin； Plasma concentration； Drug-induced liver injury

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.09.004

江西省自然科学基金(20132BAB205013)

518112 广东医学院附属深圳市第三人民医院肺二科(邓国防、孙丽珍、詹森林)，药剂科(李巍)；江西省胸科医院结核科(吴于青、邓群、雷建平)，心内科(余少良)

注：邓国防与孙丽珍对本研究具有同等贡献为并列第一作者

孙丽珍，Email：slz0311@yeah.net

2015-06-23)