Wolbachia对苹果蠹蛾生殖调控的作用

冯宏祖，曹 玉，杨明禄，刘慧敏，许建军塔里木大学/新疆建设兵团南疆特色果树生产工程实验室/农业部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站/塔里木大学南疆农业有害生物综合治理重点实验室,新疆阿拉尔 843300；新疆农业科学院植物保护研究所,新疆乌鲁木齐 83009

Wolbachia对苹果蠹蛾生殖调控的作用

冯宏祖1，曹 玉1，杨明禄1，刘慧敏1，许建军2∗
1塔里木大学/新疆建设兵团南疆特色果树生产工程实验室/农业部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站/塔里木大学南疆农业有害生物综合治理重点实验室,新疆阿拉尔 843300；2新疆农业科学院植物保护研究所,新疆乌鲁木齐 830091

【背景】苹果蠹蛾是重要的果树害虫和检疫对象。研究显示，苹果蠹蛾体内所含的Wolbachia属于具有诱导胞质不亲和(CI)现象的A组中Dor亚组。本研究目的在于摸清苹果蠹蛾体内的Wolbachia对宿主的生殖调控是否具有诱导胞质不亲和的功能。【方法】通过饲喂抗生素消除苹果蠹蛾体内的Wolbachia，比较感染与消除Wolbachia的苹果蠹蛾生态适合度以及Wolbachia感染对苹果蠹蛾生殖的影响。【结果】消除Wolbachia后，苹果蠹蛾F1、F2代各虫态的发育历期、产卵量、孵化率和蛹的存活率与对照无显著差异；Wolbachia对苹果蠹蛾成虫的寿命、产卵前期、平均产卵量和性别比例均无影响。不同处理苹果蠹蛾之间的杂交试验结果表明，4种杂交的苹果蠹蛾都能产卵，且卵可以正常孵化。【结论与意义】在自然状态下苹果蠹蛾体内的Wolbachia不能诱导其宿主的胞质不亲和现象。

Wolbachia；苹果蠹蛾；生殖调控；胞质不亲和

沃尔巴克氏体Wolbachia是一类呈母性遗传的细胞内寄生细菌，属于变形菌纲Proteobacteria的a亚群。近年的研究表明，66%以上的节肢动物(包括昆虫、螨类)种类都存在Wolbachia的感染(Hilgenboeckeret al.，2008)，并因其能操纵寄主的生殖而备受关注。Wolbachia对寄主生殖的调控主要包括胞质不亲和(Cytoplasmic incompatibility，CI)、孤雌生殖、雌性化和杀雄等，其中最常见的调控方式为诱导胞质不亲和(Serbuset al.，2008；Werrenet al.，2008)。Wolbachia导致寄主杂交细胞质不亲和现象在昆虫进化和分类学研究中具有重要意义，也为通过遗传操纵的方法防治昆虫提供了新思路(董鹏和王进军，2006)。近年来，我国在Wolbachia的分布和检测方面做了大量的工作，已在很多昆虫(螨)体内发现了Wolbachia的感染，并对其系统发育进行了分析(甘波谊等，2002；苗慧等，2006；宋社吾等，2002；王欢等，2006)。这些研究对全面掌握Wolbachia在我国昆虫中的感染情况以及分析其对节肢动物生殖的影响奠定了基础。

苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)原产于欧洲，是我国重要的进境植物检疫性害虫。目前，在我国新疆全境，甘肃、内蒙古、宁夏、黑龙江和吉林等部分地区发生，对我国东部苹果产业安全生产构成严重威胁(张润志等，2012)。作者前期的研究显示：苹果蠹蛾体内所含的Wolbachia与膜翅目细蜂科的锤角细蜂Trichopria drosophilae(Perkins)所感染的Wolbachia具有较近的亲缘关系(冯宏祖等，2014)，而锤角细蜂所含的Wolbachia属于具有诱导CI现象的A组中Dor亚组。本研究目的在于摸清苹果蠹蛾体内的Wolbachia对宿主的生殖调控是否具有诱导胞质不亲和的功能，以明确此共生细菌对苹果蠹蛾的生殖调控产生的作用及影响。

1 材料与方法

1.1 无Wolbachia苹果蠹蛾品系的培育

苹果蠹蛾成虫饲喂1.2～3.0 mg·mL－1头孢氨苄蜂蜜水溶液，幼虫饲喂含同样浓度抗生素的人工饲料，在25℃培养(RH：75%±5%)，16 h光/8 h暗，连续喂食3代，各代取20头经PCR检测(冯宏祖等，2014)体内有无Wolbachia的存在。

1.2 不同苹果蠹蛾品系杂交后的繁殖力、卵孵化率和性别比例

将消除共生微生物Wolbachia的苹果蠹蛾进行4组杂交试验(1.1结果表明，抗生素饲喂2代后已检测不出该共生菌，杂交试验虫源为饲喂抗生素的第3代苹果蠹蛾)：♀w－×♂w－、♀w－×♂w＋、♀w＋×♂w－和♀w＋×♂w＋，每个杂交组都配30对刚羽化为成虫的苹果蠹蛾，放入直径为10 cm的无色塑料杯中进行单对饲养。饲养条件：温度为(25±0.5)℃、75%～80%RH。观察记录不同杂交组的产卵量、卵孵化率和性别比例。

1.3 消除Wolbachia后苹果蠹蛾F1、F2代的生态适合度

在养虫笼内放入蜡纸并接入若干苹果蠹蛾成虫，饲喂含抗生素的蜂蜜水溶液，在(25±0.5)℃、75%～80%RH的条件下让其产卵。24 h后移去养虫笼中的成虫，将粘附有卵的蜡纸剪成若干小片，每一小片上只保存1粒卵，置于直径为10 cm的无色塑料杯中进行单头饲养；卵孵化后，在杯中加入少量的人工饲料(含抗生素)继续培养，羽化为成虫后雌雄配对，雌虫产卵后，挑取一定数量的卵，继续在相同条件下培养观察。试验一直进行到第1、2代成虫全部死亡为止。以共生有Wolbachia的苹果蠹蛾为对照，在不含抗生素人工饲料上饲养。每个处理挑取卵135头，重复3次。观察记录各虫态的发育历期、产卵量、孵化率、幼虫和蛹存活率及雌雄寿命和性别比例。

1.4 数据处理

试验所得数据按项目进行加权平均，用SPSS软件进行方差分析、显著性测验及模型拟合等，并组建实验种群生命表。

2 结果与分析

2.1 苹果蠹蛾体内Wolbachia的消除

在蜂蜜水和人工饲料中添加抗生素能去除苹果蠹蛾体内的Wolbachia。苹果蠹蛾经抗生素处理后，F1代20头中只有2头检测到Wolbachia的存在，但PCR电泳检测条带的亮度不及对照(即田间自然种群)，F2和F3代没有扩增出相应的条带，表明Wolbachia已消除。

2.2 Wolbachia对苹果蠹蛾生殖的影响

杂交试验结果(表1)表明，4种杂交的苹果蠹蛾都能产卵，且卵可以正常孵化。根据细胞质不亲和的理论，杂交♀w－×♂w＋不能产卵或所产卵不能正常孵化，说明苹果蠹蛾体内的Wolbachia不能诱导其宿主的细胞质不亲和现象。在所有的杂交组合中，当苹果蠹蛾雌雄个体同时共生有Wolbachia时产卵量最多(31.6粒)，卵的孵化率最高(84.71%)，产卵期最长(4.2 d)，产卵前期最短(2.9 d)，但与其他组合均无显著差异(P＞0.05)，说明当苹果蠹蛾雌雄个体同时被Wolbachia共生时才能达到产卵的最优化，可能有利于Wolbachia在该宿主种群的稳定存在和传播。而杂交组♀w－×♂w－的产卵量、孵化率最低。

表1 Wolbachia的感染对苹果蠹蛾生殖的影响Table 1 Effect of Wolbachia on the reproduction of C.pomonella

2.3 消除Wolbachia后苹果蠹蛾F1、F2代的生态适合度

结果表明，消除Wolbachia后苹果蠹蛾F1、F2代各虫态的发育历期、产卵量、孵化率和蛹的存活率与对照均无显著差异，而幼虫存活率与对照差异显著(表2)。这主要是由于对照的人工饲料中没有加抗生素，极易霉变，导致幼虫死亡率升高。Wolbachia对苹果蠹蛾的成虫寿命、产卵前期和性别比例均无影响(表3)。

表2 消除Wolbachia后苹果蠹蛾各虫态的发育历期和存活率Table 2 The development duration and survival of C.pomonella after eliminating Wolbachia

表3 消除Wolbachia后苹果蠹蛾的雌性比、寿命和产卵前期Table 3 The female ratio，life span，preoviposition period of C.pomonella after eliminating Wolbachia

2.4 消除Wolbachia后苹果蠹蛾F1、F2代的种群生命表

根据苹果蠹蛾种群的存活率和成虫繁殖力，分别组建消除Wolbachia后苹果蠹蛾F1、F2代的实验种群特定年龄生命表(表4)，表中的起始卵数为假定数，各发育阶段的存活率、雌成虫比例、单雌产卵量均为实际观察值。下代产卵量由起始数量、世代存活率、雌性比和平均产卵量的乘积求得，种群趋势指数是预计下代卵量与当代实际卵量的比值。结果表明，CK、F1、F2代的种群趋势指数分别为2.73、3.73、2.89，均大于1，表明下代种群数量都呈增长趋势。由于人工饲料饲养苹果蠹蛾中，产卵量低、幼虫死亡率高(尤其是不加抗生素的对照)的问题未得到解决，3个处理的种群趋势指数均比较小。以净增殖率为指标，感染和未感染Wolbachia的苹果蠹蛾种群的适合度无显著差异。

表4 消除Wolbachia后苹果蠹蛾F1、F2代的种群生命表Table 4 The life table of C.pomonella eliminating Wolbachia from F1，F2generation

3 讨论

近年来的研究表明，Wolbachia除具有调控宿主生殖的作用外，对宿主适合度也有不同程度的影响，但其能够在寄主种群中稳定遗传，更多地依赖于其对寄主产生的生殖调控作用(潘雪红等，2007；杨克冬等，2008；Serbuset al.，2008；Werrenet al.，2008)。一些Wolbachia品系能够提高节肢动物雌性宿主的生殖力，而双翅目和膜翅目昆虫中的Wolbachia能够降低宿主的生命周期、存活率和运动能力等(Fryet al.，2004)。目前，昆虫等节肢动物受Wolbachia感染后，是否存在CI现象、CI产生的机理等是Wolbachia研究最热门的领域之一。本研究采用抗生素处理的方法去除了苹果蠹蛾体内的Wolbachia，进而研究Wolbachia感染对苹果蠹蛾生殖及适合度的影响。结果表明，经抗生素处理后，F2和F3代中的Wolbachia已清除。消除Wolbachia后苹果蠹蛾F1、F2代各虫态的发育历期、产卵量、孵化率和蛹的存活率与对照无显著差异；Wolbachia对苹果蠹蛾成虫寿命、产卵前期和性别比例均无影响。此外，4种杂交的苹果蠹蛾都能产卵，且卵可以正常孵化，说明在自然状态下苹果蠹蛾体内的Wolbachia不能诱导其宿主的细胞质不亲和现象。这与同苹果蠹蛾具有亲缘关系的锤角细蜂受Wolbachia的影响截然不同，是否与苹果蠹蛾的生存环境、共生菌消除方式有关，还需进一步研究。同时，本试验只对4组苹果蠹蛾每雌平均产卵量、孵化率进行了统计分析，而Wolbachia对苹果蠹蛾的影响是否会在其继代中表现或累计表现，也需要进一步验证。既然Wolbachia不能诱导苹果蠹蛾的细胞质不亲和现象，那么其对苹果蠹蛾起何作用仍亟待研究。

董鹏，王进军.2006.沃尔巴克氏体Wolbachia对宿主的生殖调控作用及其研究进展.昆虫知识，43(3)：288－294.冯宏祖，王月萍，曹玉，杨明禄，刘慧敏，许建军.2014.苹果蠹蛾体内Wolbachia的wsp基因克隆与序列分析.应用昆虫学报，51(3)：725－732.

甘波谊，周伟国，冯丽冰，沈大棱，李昌本.2002.沃尔巴克氏体在中国三种稻飞虱中的感染.昆虫学报，45(1)：14－17.

苗慧，洪晓月，谢霖，薛晓峰.2006.二斑叶螨体内感染的Wolbachia的wsp基因序列测定与分析.昆虫学报，49 (1)：146－153.

潘雪红，何余容，陈科伟，潘飞，盘梅.2007.Wolbachia感染对拟澳洲赤眼蜂寿命、生殖力和嗅觉反应的影响.昆虫学报，50(3)：207－214.

宋社吾，赵彤言，董言德，蒋书楠，陆宝麟.2002.我国蚊虫体内感染的Wolbachia的wsp基因序列测定与分析.昆虫学报，45(5)：571－577.

王欢，李凯，刘怀，胡萃，叶恭银.2006.两种金小蜂体内Wolbachia的wsp基因分子检测及序列分析.植物保护学报，33(3)：235－240.

杨克冬，张海燕，钱海涛，董辉，张莹，丛斌.2008.沃尔巴克氏体感染对松毛虫赤眼蜂生殖力、发育历期和存活的影响.中国生物防治，24(3)：210－214.

张润志，王福祥，张雅林，陈汉杰，罗进仓，王勤英，刘万学，艾尼瓦尔·木沙，等.2012.入侵生物苹果蠹蛾监测与防控技术研究——公益性行业(农业)科研专项( 200903042)进展.应用昆虫学报，49(1)：37－42.

Fry A J，Palmer M R and Rand D M.2004.Variable fitness effects ofWolbachiainfection inDrosophila melanogaster. Herediy，93：379－389.

Hilgenboecker K，Hammerstein P，Schlattmann P，Telschow A and Werren J H.2008.How many species are infected withWolbachia?A statistical analysis of current data.FEMS Microbiology Letters，281：215－220.

Serbus L R，Casper-Lindley C，Landmann F and Sullivan W. 2008.The genetics and cell biology ofWolbachiahost interactions.Annual Review of Genetics，42：683－707.

Werren J H，Baldo L and Clark M L.2008.Wolbachia：master manipulators of invartabrata biology.Nature Reviews Microbiology，6：741－751.

(责任编辑：杨郁霞)

The effects of Wolbachia on the reproduction of Cydia pomonella(L.)

Hong-zu FENG1，Yu CAO1，Ming-lu YANG1，Hui-min LIU1，Jian-jun XU2∗
1Tarim University/Engineering Laboratory of Featured Fruit Tree in Southern Xinjiang，XPCC/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar，Ministry of Agriculture，P.R.China/Southern Xinjiang Key Laboratory of IPM of Tarim University，Alar，Xinjiang 843300，China；2Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi，Xinjiang 830091，China

【Background】Codling moth(Cydia pomonella)is the most serious fruit tree and quarantine pest in Chinese orchards. The species is host toWolbachia，Dor subgroup of the A group，which induce cytoplasmic incompatibility.The aim of this study is to find out if theWolbachiainduce cytoplasmic incompatibility to reproductive regulation inC.pomonella.【Method】The relative fitness ofC.pomonellawith activeWolbachiawas compared to individuals in whichWolbachiawas eliminate by antibiotics.【Result】We found no significant differences in development duration，fecundity，hatchability and pupal survival of the F1，and F2generations between the two groups.Wolbachiainfection had no effect on adult life span，the pre-oviposition period，fecundity and female ratio inC.pomonella.Hybridization tests showed that hybrids could lay eggs，and these eggs were normal.【Conclusion and significance】WolbachiainC.pomonelladid not induce host cytoplasmic incompatibility.

Wolbachia；Cydia pomonella(L.)；reproduction manipulation；cytoplasmic incompatibility

10.3969/j.issn.2095-1787.2015.04.009

2015－05－12 接受日期(Accepted)：2015－09－28

国家自然科学基金(31060242)；新疆维吾尔自治区财政林业科技专项(新林计发[2014]40号文)

冯宏祖，男，教授。研究方向：害虫综合治理。E-mail：fhzzky＠163.com

∗通讯作者(Author for correspondence)，E-mail：xjj＠163.com