一种增强苹果蠹蛾颗粒体病毒田间防效方法的建立

樊江斌，吴正伟，刘国锋，王 敦

西北农林科技大学植保资源与害虫治理教育部重点实验室,陕西杨凌 712100

一种增强苹果蠹蛾颗粒体病毒田间防效方法的建立

樊江斌，吴正伟，刘国锋，王 敦∗

西北农林科技大学植保资源与害虫治理教育部重点实验室,陕西杨凌 712100

【背景】苹果蠹蛾是危害苹果和梨等蔷薇科果实的世界性重要蛀果害虫之一，目前已侵入我国新疆、甘肃、黑龙江、宁夏、内蒙古、吉林、辽宁等7省市，正在向苹果主产区扩散，严重威胁我国苹果产业的发展。欧美国家的田间应用证明，CypoGV是防治苹果蠹蛾效果最佳的生防制剂。研究开发本土CypoGV商业化制剂，对保证我国苹果业健康发展有重大意义。【方法】用室内和田间生测方法，在半人工饲料中添加被紫外线处理过的氧化铁和CypoGV-ZY混合悬液，其中氧化铁的添加浓度分别为3、5、7、10、12 mg·mL－1，并完成其对苹果蠹蛾初孵幼虫的生物测定。【结果】在病毒悬液中添加7 mg·mL－1的氧化铁能显著提高CypoGV在田间的活性和持久性，与未添加氧化铁处理相比较，初孵幼虫死亡率分别提高了53.88%和96.64%。【结论与意义】添加低剂量氧化铁，显著增强了CypoGV对田间强日光、强紫外线的适应性，提高了该病毒在田间的活性和持久性，说明氧化铁可作为商业化CypoGV制剂的助剂，提高田间CypoGV对苹果蠹蛾防治效果。本研究为我国CypoGV制剂生产过程中添加助剂提供了依据。

氧化铁；UV；生物测定；存活率；增效剂

苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)是世界范围内苹果和梨等蔷薇科果树的重要害虫之一，是我国重要的入侵生物和检疫害虫(杜磊等，2012；努尔古丽·马坎等，2014；Garczynskiet al.，2011；Wearinget al.，2011)。1953年在我国新疆库尔勒首次发现苹果蠹蛾，其初孵幼虫蛀入果实内部为害直至老熟幼虫脱果，以老熟幼虫在树皮裂缝等隐蔽处越冬，对环境具有很强的适应能力(徐婧等，2012；张学祖，1957；周昭旭等，2008)。目前，该害虫正从西北地区(新疆、甘肃)和东北地区(黑龙江、吉林)蔓延至苹果适生区和主产区，对这些地区的苹果产量和品质构成严重威胁(张润志等，2012)。

由于化学药剂防治带来的抗药性、环境污染及农药残留问题，应用赤眼蜂Trichogramma chilonisIshii(王兰等，2011；Stefet al.，2010)、斯氏科线虫Steinernema carpocapsae(Weiser)(Laceyet al.，2003)、苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Berliner)(liuet al.，2013)、苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonellagranulovirus，CypoGV)(Berlinget al.，2009；Lawrenceet al.，2008)等生物防治技术控制苹果蠹蛾发展迅速。在欧美等地已有10种苹果蠹蛾颗粒体病毒制剂(SAN 406、Virosoft、CarpovirusineTM evo2、CarpovirusineTM 2000、CYD-XHP、MadexTM Biocontrol、GranupomTM、CarpovirusineTM、Cyd-XTM、Virosoft CP4等)被登记(南宫自艳等，2014；Lacey＆Arthurs，2005)。我国利用CypoGV防治苹果蠹蛾研究起步较晚，目前已分离到CypoGV-ZY、CypoGV-CJ01、CypoGV-KS1、CypoGVKS2、CypoGV-C1等本土病毒株系，并完成了室内毒力及田间防治效果试验(甘恩宇等，2011；申建茹等，2012；liuet al.，2013)。2013年CypoGV-ZY(张掖株)病毒杀虫剂制剂技术获得国家发明专利(专利号201010013631.9)。这些研究成果为我国CypoGV商业化生产奠定了基础。

昆虫杆状病毒进入昆虫体内后，通常需要7～10 d才能杀死寄主，添加助剂可提高其田间防效和持久性。研究证实，添加几丁质酶和BtCry1Ab毒素蛋白能分别缩短LT50和LT90(刘强等，2010；吕婷婷等，2013)；氧化铁(黑色)和增白剂能提高其他昆虫杆状病毒的紫外线耐受性(Asano，2005；Doughertyet al.，1996)；添加紫外线保护剂二氧化钛和氧化锌能提高CopyGV对紫外线的抵抗力(Wuet al.，2015)。本研究利用氧化铁作为CypoGV-ZY在田间的保护增效剂，研究其对病毒毒力和活性的影响，为开发新型商业化CypoGV-ZY制剂及其田间应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

苹果蠹蛾为本试验在甘肃农业大学草业学院建立的室内种群，已连续饲养20多代。先收集虫卵，进入黑头期后用NaClO表面消毒，选择孵化8～12 h的幼虫为供试虫源。试虫饲养条件参数：(25± 0.5)℃、RH(60±7)%、16 h∶8 h(L∶D)，幼虫取食的半人工饲料参照樊江斌等(2015)方法制备。

1.2 CypoGV-ZY及氧化铁

苹果蠹蛾颗粒体病毒CypoGV-ZY由西北农林科技大学植物保护学院分子病毒学实验室保存，在甘肃农业大学草业学院扩繁并纯化，制成浓度1× 1010OBs·mL－1，4℃保存。氧化铁购自天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.3 试验方法

微量氧化铁15 mg·mL－1饲喂试虫，将2 μL该化合物添加到体积约4.5 mm3的饲料块内，待初孵幼虫取食完全后更换新饲料块。测定30头，供试幼虫均未中毒死亡，表明低剂量氧化铁对苹果蠹蛾初孵幼虫无明显毒性。因此本试验选取氧化铁浓度3～12 mg·mL－1。设置CypoGV-ZY和蒸馏水2个对照。

1.3.1 氧化铁对CypoGV-ZY保护增效作用的室内生测 配制1×104OBs·mL－1的CypoGV-ZY(Wuet al.，2015)与不同浓度的氧化铁混匀液，氧化铁终浓度分别为3、5、7、10、12 mg·mL－1。病毒混合液在小培养皿中避光自然晾干，然后将其置于UVB紫外灯管(40 W)下照射4 h，再加入等体积蒸馏水。以未添加氧化铁的病毒为对照。滴加2 μL上述病毒悬液至4.5 mm3饲料块上，幼虫取食完饲料块后，添加新鲜饲料，逐日记录死亡和存活虫数，直至所有幼虫死亡或化蛹。参照Eberleet al.(2009)计算7 d内死亡率，按照Abbort(1987)方法计算校正死亡率。每个处理30头幼虫，3个重复。

1.3.2 氧化铁对CypoGV-ZY保护增效作用的田间试验 病毒强日照田间处理选择在我国日照强烈的新疆地区进行。向1×106OBs·mL－1的CypoGV中添加氧化铁，制成氧化铁终浓度分别为3、5、7、10、12 mg·mL－1的混合液。将混合液转移到培养皿中自然晾干，然后移至新疆塔里木大学苹果园中，选择强日照天气处理7 d后，用同体积蒸馏水重悬浮病毒氧化铁混合液。设置未添加氧化铁的日光处理的病毒为对照。毒力测定参照1.3.1。

1.4 数据分析

使用SPSS 17.0(SPSS Inc，USA)进行数据分析，采用Duncan氏多重比较分析不同处理间的差异显著性。采用GraphPad Prism 5绘图软件做图。

2 结果与分析

2.1 氧化铁对CypoGV-ZY的室内保护增效作用

室内生测结果表明，添加不同浓度氧化铁的病毒经UVB处理4 h后，对苹果蠹蛾初孵幼虫的死亡率明显高于未添加氧化铁的对照组，差异极显著(F5，12＝22.24，P＜0.01)(图1A)。当氧化铁浓度为7 mg·mL－1时，幼虫死亡率最高(70.77%)，与氧化铁浓度5 mg·mL－1相比，幼虫死亡率差异不显著(P＞0.05)，但比未添加病毒的处理增加了53.88%。UVB照射病毒后幼虫存活率53.33%(图1B)，添加5 mg·mL－1氧化铁后再被UVB照射，幼虫存活率降至33.33%，而未被UVB照射的对照组幼虫存活率仅为13.33%，表明低剂量氧化铁能帮助病毒抵抗UVB伤害，进而提高其对宿主昆虫的毒力。

图1 不同浓度氧化铁对CypoGV-ZY的增效作用(室内)Fig.1 The enhancement on Cydia pomonella granulovirus virulence at different concentrations of Fe2O3under laboratory conditions

2.2 氧化铁对CypoGV-ZY的田间保护增效作用

昆虫病毒制剂在田间应用过程中，强紫外线容易杀死病毒，减弱病毒制剂在田间的防治效果。图2表明添加氧化铁的病毒经强日照处理，对苹果蠹蛾初孵幼虫的死亡率明显高于未添加氧化铁的对照组，并随着氧化铁浓度增加，差异极显著(F5，12＝36.23，P＜0.01)，表明添加氧化铁能提高病毒对强日照环境的抵抗力及田间持久性。向CypoGV-ZY添加氧化铁终浓度7 mg·mL－1，初孵幼虫死亡率70.77%，比对照提高了96.64%。

3 讨论

昆虫杆状病毒具有寄主专化性和非靶标生物安全的特点，目前被广泛应用于害虫防治。但病毒离开活体寄主，其活性在外界环境中受到多种非生物因子的影响。

图2 不同浓度氧化铁对CypoGV-ZY的增效作用(田间)Fig.2 The enhancement on Cydia pomonella granulovirus virulence at different concentrations of Fe2O3under field essay

紫外线(UV)是一种严重影响核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)和颗粒体病毒(Granulosis virus，GV)活性和持久性的非生物因素之一。通过添加吸收剂和反射剂等紫外线保护剂，能够阻止UV到达病毒体上，减弱UV对病毒造成的伤害(Wuet al.，2015)。Jaques(1971)验证了29种物质都可作为粉纹夜蛾核型多角体病毒的UV保护剂。

室内研究表明，UV造成CypoGV失活是一个双峰曲线，大部分(约99%)病毒很快失去活性，而少部分表现为持久活性(Huber＆Luedcke，1996)。二氧化钛和氧化铁能增强Helicoverpa zeaNPV及Homona magnanimaGV在UV下的稳定性，从而提高病毒活性和持久性(Asano，2005；Farraret al.，2003)。病毒生测试验结果证明，UV处理时添加1～4 mg·mL－1氧化铁，能够减少1/6～1/18的病毒失活(Asano，2005)。本研究中，未添加氧化铁保护剂的CypoGV被UVB照射后，幼虫存活率53.33%，而添加5 mg·mL－1氧化铁的CypoGV，UVB再处理时，幼虫存活率降低至33.33%。田间应用表明，喷雾3 d后CypoGV感染活性减半，而在4～8周后部分CypoGV仍持有感染活性(Glen＆Payne，1984)。添加木质素、二氧化钛和蔗糖的CypoGV制剂比商业化添加甘油的CypoGV制剂(Cyd-X)，能够保护病毒免受紫外线伤害，使苹果蠹蛾的死亡率提高26%～27%(Arthurset al.，2006)。本研究通过室内和田间生测，表明添加氧化铁可提高CypoGV对UVB抵抗力。随着氧化铁浓度增加，幼虫死亡率先升后降，可能是因为高浓度氧化铁影响病毒入侵昆虫中肠细胞。当氧化铁浓度为7 mg·mL－1时，显著增强了CypoGV的活性和持久性；初孵幼虫存活率曲线也证明氧化铁对CypoGV具有保护作用，它能减弱UV对病毒的损害，提高CypoGV的防治效果。研究表明，氧化铁可作为CypoGV的添加剂，增强CypoGV对苹果蠹蛾的田间防治效果，这为我国CypoGV制剂本土化生产提供了依据。

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(责任编辑：郭莹)

Synergic enhancement of Cydia pomonella granulovirus virulence using an adjuvant

Jiang-bin FAN，Zheng-wei WU，Guo-feng LIU，Dun WANG∗
Key Laboratory of Plant Protection Resources＆Pest Management of the Ministry of Education，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China

【Background】Cydia pomonella(L.)is a worldwide major fruit-boring pest of rosaceae family such as apples and pears. It has so far infested Xinjiang，Gansu，Heilongjiang，Ningxia，Inner Mongolia，Jilin，and Liaoning provinces，China.This pest is spreading towards the major apple production areas，which can result in a great threat to apple industry in China.CypoGV is considered the best biological agent to control codling moth(C.pomonella)in Europe and America.It is important to develop domestic CypoGV commercial agents to protect apple production in China.【Method】The virulence to neonate larvae were tested in laboratory and field bioassay using the mixtures of CypoGV-ZY with different Fe2O3concentrations(3，5，7，10，12 mg·mL－1)treated with UV，and sunlight.【Result】The virulence and persistence of CypoGV-ZY were significant increased when mixed with 7 mg·mL－1Fe2O3in both bioassays.It also enhanced CypoGV-ZY adaptability to strong UV and sunlight.Compared to control of CypoGV-ZY，mortality rate increased 53.88%and 96.64%，in laboratory and field bioassay，respectively.【Conclusion and significance】The virulence and persistence of CypoGV-ZY were markedly enhanced by adding low dose of Fe2O3，which showed that this compound was a proper candidate adjuvant for CypoGV-ZY.The results will provide the basis for commercial production of CypoGV-ZY.

Fe2O3；UV；bioassay；survival rate；synergistic agent

10.3969/j.issn.2095-1787.2015.04.010

2015－06－20 接受日期(Accepted)：2015－07－18

国家自然科学基金(31170609、31270691)

樊江斌，男，硕士研究生。研究方向：昆虫生理生化。E-mail：fanjiangbin1987＠sina.com∗

Author for correspondence)，E-mail：wanghande＠nwsuaf.edu.cn