四个不结球白菜自交不亲和S单元型分子鉴定

李霞等

摘要：利用已报道的SRK及SLG基因序列保守区设计的特异性引物，通过PCR 扩增和克隆测序，结合生物信息学分析方法对4份国外引进的不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）自交不亲和材料的S单元型进行分子鉴定。结果表明，不亲和材料A1包含的S位点基因序列与甘蓝（B. oleracea L. var. capitata L.）SLG-31的相似度为98%（E值是0）；不亲和材料A2、A3包含ClassI类及ClassⅡ类2种S单元型，S位点处于杂合状态。不亲和材料A4包含的S位点基因序列与青花菜（B. oleracea L. var. italica Plenck）单倍型BOI1 SRK蛋白基因具有98 %的序列相似度，序列覆盖度达99%。

关键词：不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）；自交不亲和；S单元型；分子鉴定

中图分类号：S634.3；Q321+.7；Q503 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）16-3948-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.030

Molecular Identification of S Haplotypes in Four Self-Incompatible Germplasm Resources of Brassica campestris ssp. chinensis

LI Xia，HU Zhen-hua，ZHOU Guo-lin，WANG Ai-hua

（Wuhan Vegetable Demonstration Center of Wuhan Vegetable Research Institute， Wuhan 436400， China）

Abstract： Using the primers designed according to the conserved sequence of S locus kinase （SRK） gene and S locus glycoprotein （SLG） gene， by PCR amplification， combined with bio-informatics analysis the S haplotypes of 4 Brassica campestris ssp. chinensis Makino self-incompatibility material from overseas were identified. The results indicated that the A1 self-incompatible line showed 98% similarity with SLG-31 gene in B. oleracea L. var. capitata L.； and the A2， A3 self-incompatible line both contained two types of S haplotype from Class I and ClassⅡ， which showed that the S locus were at heterozygous state. The A4 self-incompatible line showed 98% similarity with BOI1 SRK gene in B. oleracea L. var. italica Plenck under 99% query coverage.

Key words： Brassica campestris ssp. chinensis Makino； self-incompatibility； S haplotype； molecular identification

白菜（Brassica campestris L.）属十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica L.），原产于中国，栽培历史悠久。其规模无论是面积还是产量，在蔬菜作物中均居首位。不结球白菜，又称小白菜（B. campestris L. ssp. chinensis Makino），主要分布在长江流域的中、下游地区，其播种面积约占该地区蔬菜总面积的1/3。白菜为典型的异花授粉作物，杂种优势显著，利用自交不亲和（Self-incompatibility）系制种是目前最常用的白菜杂交制种技术之一，其主要靠不同单倍型自交不亲和系之间互配来获得，因此对于育种工作者来说，获得自交不亲和系单倍型的快速准确鉴定至关重要。目前普遍采用花期交互授粉的方法进行鉴定，其操作过程繁杂、效率低、准确度不高[1]。快速、准确的鉴定白菜自交不亲和性以及所携带的S单元型（在遗传上由具有复等位基因的多态性S位点基因控制的单元类型），不仅可以加速自交亲和系和自交不亲和系的选育进程，而且可以做到有针对性地配制杂交组合、提高育种效率、避免杂交不结实现象发生。

自交不亲和现象是植物在长期进化过程中促进异花授粉、保证物种生存、延续的生殖特性。根据遗传控制不同，显花植物的自交不亲和特性大致可分成配子体自交不亲和（Gametophytic self-incompatibility，GSI）与孢子体自交不亲和（Sporophytic self-incompatibility，SSI）2种类型[2]。配子体自交不亲和是植物界最普遍的一种自交不亲和类型，而孢子体自交不亲和仅存在于十字花科、石竹科（Caryophyllaceae）、菊科（Compositae）等植物中。芸薹属是十字花科孢子体控制型的典型代表，研究表明，芸薹属植物自交不亲和性受单位点（S-locus）复等位基因（S1，S2，……，Sn）的控制，在白菜自交不亲和研究中已鉴定出100多种S单元型[3， 4]。目前，自交不亲和机理研究认为，自交不亲和现象的发生是花粉与柱头乳突细胞间的自我识别引起的，其识别过程主要体现为S单倍型特异性的受体-配体识别机制，参与这一识别过程的蛋白主要包括：S位点糖蛋白基因（S locus glycoprotein gene，SLG基因）、S位点受体激酶基因（S locus receptor kinase gene，SRK基因）、花粉蛋白外壳基因（S locus cysteine-rich protein gene，SCR基因）。其中SLG和SRK为柱头表达蛋白基因，SCR为花粉壁中存在的特异因子基因，3个紧密连锁的基因参与了花粉和柱头间的相互识别[5-7]。随着分子生物学技术的不断发展及芸薹属植物自交不亲和性的深入研究，若干S单元型SLG、SRK和SCR基因序列也已确定。随着DNA测序技术的飞速发展，通过生物信息学分析，白菜自交不亲和S单元型分子水平的快速鉴定也已成为可能。

试验利用已公布的SRK、SLG基因特异引物的PCR扩增、克隆测序及生物信息学分析等技术，对4份引进的小白菜自交不亲和材料A1、A2、A3、A4的S单元型进行分子鉴定，以期为小白菜杂交组合的授粉配制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参试的不结球白菜自交不亲和材料A1，A2，A3及A4都从国外引进，由武汉市蔬菜科学研究所提供。离心柱型PCR产物回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，pMD18-T载体购于宝生物工程 （大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 选取各材料的幼嫩叶片，利用改良的CTAB小样法提取4份试验材料的基因组DNA，置于-20 ℃环境保存备用。

1.2.2 引物设计 利用已报道的特异性引物PS5和PS15，该引物是由Nishio等[8]设计的用于扩增ClassⅠ类（S单元型在花粉中表现为显性）SLG的引物，特异引物P3和P4是张爱芬[9]设计用于扩增ClassⅡ类（S单元型在花粉中表现为隐性）SRK基因的引物，引物序列见表1，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2.3 PCR扩增 分别以4份材料的基因组DNA为模板，PCR 反应体系为20 μL。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s， 35个循环； 72 ℃延伸10 min，25 ℃保存。在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳产物检测，紫外凝胶成像系统拍照。

1.2.4 目的片段的回收及克隆 利用PCR产物回收试剂盒对目的片段进行回收，将回收DNA片段连接到pMD18-T载体上，转化到感受态大肠杆菌（Escherichia coli）上，进行蓝白斑筛选，对阳性克隆进行PCR鉴定。

1.2.5 测序及序列分析 对于鉴定的阳性克隆送样测序，每个样品测定2～3 个阳性克隆，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司实施。序列分析利用DNAstar 软件完成；Blast分析通过NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线进行。

2 结果与分析

2.1 S单元型相关基因的PCR扩增

利用芸薹属ClassⅠ类S单元型SLG基因特异性引物组合PS5+PS15及ClassⅡ类SRK基因特异性引物组合P3+P4对4份自交不亲和材料A1、A2、A3、A4进行PCR扩增，结果见图1。从图1可见，A1材料只在PS5+PS15引物组合中有扩增产物，A4只在P3+P4引物组合中有扩增产物，而A2、A3在2对引物扩增条件下都有特异性条带出现。以上结果表明，A1可能属S单元型中的ClassⅠ类，A4则属于ClassⅡ类S单元型。A2和A3的扩增结果表明在这2份不亲和材料中很有可能包括了2类S单元型，在S位点表现为杂合类型。为了进一步对以上结果进行验证，对上述4份自交不亲和材料中扩增出的目标片段进行回收，并分别连接到pMD18-T载体上，进行大肠杆菌转化，挑取阳性克隆进行序列测定。

2.2 自交不亲和材料扩增序列的Blast分析

将4份自交不亲和材料扩增产物的DNA序列测定结果与NCBI已登录的芸薹属核苷酸序列进行Blast比对，以进一步确定它们的S单元型。Blast分析表明，自交不亲和材料A1由PS5+PS15引物所扩增出的1 356 bp的片段经克隆测序结果比对后发现，其与甘蓝（B. oleracea L. var. capitata L.）SLG-31（GenBank 登录号 AB054729.1）在序列覆盖率为94%的情况下，相似度为98%（E值是0）。而与白菜S位点蛋白1基因（GenBank 登录号 HM629338.1）在序列覆盖度为80%的情况下，与其CDS序列相似度达到了99%（E值是0）。以上结果显示，自交不亲和材料A1的S位点基因序列在较高的序列覆盖度情况下，与甘蓝SLG-31具有较高的相似度；而与白菜蛋白基因1所属的S单元型在较低的序列覆盖度下序列相似度更高。因此，要准确鉴定其S单元型，需要进一步的试验来验证。

自交不亲和材料A2在2对引物扩增条件下都有扩增条带产生，包括1 356 bp及1 046 bp 2条特异性扩增条带。对1 394 bp的序列进行比对后发现，该序列与白菜的S位点糖蛋白SLG-30基因（GenBank登录号 D85217.1）及芜菁（B. rapa L.ssp.rapifera Matzg）的S位点受体激酶基因SRK-30 （GenBank登录号AB054693.1）的序列具有很高的相似度，分别为99%和98%。因此基本可以确定不亲和材料包含S30这一单元型。对1 059 bp片段的序列比对后发现，其与芜菁SRK-60、SLG-60基因（GenBank 登录号 AB097116.1）在覆盖度为99%的情况下，相似度也高达99%，远远高于其他单元型，因此可以确定该序列属于S60单元型。所以自交不亲和材料A2基本上可以确定其具备S30、S60这2种S单元型，再一次证明自交不亲和材料A2在S位点为杂合状态。

自交不亲和材料A3也如A2材料，在ClassⅠ类及ClassⅡ类S单元型引物中都扩增出了对应的目的条带，分别为1 356 bp及1 046 bp。对2条序列的分析结果表明，前者与萝卜（Raphanus sativus L.）SGT-63基因（GenBank登录号 EF056499.1）在序列覆盖率为98%的条件下，序列相似度为99%；后者则与青花菜（B. oleracea L. var. italica Plenck）单倍型BOI1 SRK蛋白基因（GenBank登录号 JQ253785.1）具有98%的序列相似度，序列覆盖度达99%。以上结果表明，不亲和材料A3在S位点也证实为杂合状态。

自交不亲和材料A4属于ClassⅡ类S单元型，对其1 046 bp片段的序列分析结果（图2）表明，自交不亲和材料A4所包含的ClassⅡ类S位点基因序列与自交不亲和材料A3中的S位点基因序列一致，2个材料应包含同一类型的S基因。

3 讨论

白菜为典型的异花授粉作物，杂种优势显著。利用自交不亲和系制种，主要靠不同单倍型自交不亲和系之间的互配来获得，因此对于育种工作者来说，获得自交不亲和系单倍型的快速鉴定至关重要。目前已有很多鉴定自交不亲和性的方法，主要包括：亲和指数法[10]、荧光显微法[11]、等电点聚焦电泳法[12]、免疫测定法[13]、RFLP-PCR（Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction，限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应）分子鉴定法[9]。以上方法难以对所研究材料进行准确的S单元型鉴定。随着DNA测序技术的迅速发展，以及公开报道的S单元型序列的增多，使得通过PCR扩增后直接测序来判定自交不亲和材料的S单元型成为可能。分子鉴定法能够实现早期对植株自交不亲和性S单元型的鉴定，从而大大提高了检测效率，避免了杂交不结实现象的发生，具有非常广阔的应用前景。本研究利用SLG及SRK基因的保守序列设计的引物，对4份不结球白菜进行了S单元型的分子鉴定，结果表明，该方法基本可以鉴定出4份材料的S单元型类型，其中发现ClassⅠ类和ClassⅡ类S单元型同时出现在自交不亲和材料A2和A3中，这种现象在前人的研究中也有相关的报道。张爱芬[9]对16份不结球白菜材料S单元型的鉴定中，发现有11份材料同时扩增出ClassⅠ类和ClassⅡ类2种类型，自交不亲和S位点处于杂合状态；这种现象也曾在白菜的一些自交不亲和系中出现过，其原因可能是由于其自交不亲和性导致其自我结实困难、而外来花粉在繁殖过程中又极易侵入、造成在表型上很难加以区分基因位点的杂合与否所产生的[14]；因此，出现了很多亲本材料在S位点上并不是完全纯合的现象。所以在进行新的不亲和种质资源引进及繁殖不亲和材料时，应该严防外来花粉的侵入，做好隔离措施，以保证其纯度，同时辅以分子技术手段快速实现其S单元型的鉴定，从而提高不亲和材料系的选育及组合选配效率。

此外，在对4份白菜自交不亲和材料的S单元型鉴定的过程中还发现，在做S位点基因序列分析时，其中大部分序列与甘蓝、萝卜等其他十字花科作物中所包含的的S位点基因序列表现出了极高的相似度。例如，在自交不亲和材料A3中其1 356 bp片段的序列分析结果表明，A3与萝卜S位点糖蛋白SGT-63基因（GenBank登录号 EF056499.1）在序列覆盖度为98%的条件下，序列相似度为99%；而自交不亲和材料A4所包含的S基因序列与青花菜单倍型BOI1 SRK蛋白基因（GenBank登录号 JQ253785.1）具有98%的序列相似性，序列覆盖度达99%。在十字花科不亲和研究中，通过比较基因组研究发现，青花菜和芜菁的S位点基因具有高度的相似性，白菜中S单倍型S46、S47、S8分别和甘蓝的3种S单倍型S7、S12、S32在SRK基因方面均有高度的相似性，种间杂交发现它们之间也表现出相同的自交不亲和识别特异性[15]。同样萝卜属（Raphanus L.）作物萝卜也具有和芸薹属作物高度同源的SLG、SRK和SP11基因，经过核酸序列的聚类分析并不能将两者分开。这些数据表明，十字花科S位点基因的多态性在芸薹属和萝卜属分化成不同的种属以前已经形成，并很可能来自于共同的祖先[16]。本研究中，4份自交不亲和材料所包含的几种S单元型，从基因组序列分析的结果来看，与甘蓝及萝卜中的一些S位点基因序列相似度很高，是不是具有相同的识别特异性，还有待进一步通过试验来证实。

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