HPLC-DAD法检测染红中药材中20种非法添加色素*

李启艳，朱日然，孙萍，姜国萍

(1.山东中医药大学，济南 250355；2.山东中医药大学附属医院药学部，济南 250011；3.山东省食品药品检验研究院，济南 250101)

HPLC-DAD法检测染红中药材中20种非法添加色素*

李启艳1，3，朱日然2，孙萍2，姜国萍1

(1.山东中医药大学，济南 250355；2.山东中医药大学附属医院药学部，济南 250011；3.山东省食品药品检验研究院，济南 250101)

目的 建立高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法同时测定常见染红中药材中非法添加的20种人工合成色素。方法 采用70%甲醇超声提取样品，通过Agilent TC-C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)分离，以甲醇-0.02 mol·L-1醋酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，于210～650 nm波长范围用DAD检测，用保留时间结合待测物的紫外吸收光谱验证。结果 同时分离并检测出20种常用红色及橙色系色素，市售西红花、朱砂中检出酸性橙Ⅱ及808猩红。结论 该方法可同时检测常见染红中药材中常用的非法添加人工合成色素，样品处理简便，方法快速，结果准确可靠，重复性好。

中药材，染色；检测器，高效液相色谱-二极管阵列；色素检测；色素，人工合成；朱砂；酸性橙Ⅱ

目前，中药特别是中药饮片的非法染色掺假的现象较多，其中色泽鲜艳、价格昂贵、临床使用频繁的红色系药材如西红花、朱砂、血竭、丹参等的染色品种更是屡见不鲜[1]，染色药材不仅贻误病情，甚至还有毒性[2]，会对人体造成不同程度的危害。若染色药材经进一步加工炮制，其中的化工染料受热分解产生新的有害物质，对人体危害可能更大[3]。高效液相色谱可以连接不同检测器并进行定量分析，灵敏度高，分离效果好，是目前色素检测中使用最广、研究最多的方法，也是国内检测色素添加剂的标准方法[4]。因此，笔者建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器(high performance liquid chromatography-diode array detection,HPLC-DAD)法同时测定常见的20种红色和橙色类人工合成色素，其中包含苏丹红等偶氮类强致癌色素品种，可以为药品监督管理部门控制中药质量提供一定的参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪带二极管阵列检测器；Milli-Q 超纯水机；Mettler Toledo MS 十万分之一电子天平；KQ-500DE 型数控超声仪。

1.2 试剂 对照品：金橙Ⅰ(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110711)、酸性橙Ⅱ(阿拉丁试剂有限公司，批号：D1205024)、金橙Ⅳ(国药集团化学试剂有限公司, 批号：F20121210)、金橙G(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20120311)、甲基橙(国药集团化学试剂有限公司，批号：20070815)、罗丹明B (阿拉丁试剂有限公司，批号：D120502)、碱性橙2 (德国CNW试剂有限公司, 批号：6A15G020)、碱性橙21(德国CNW试剂有限公司, 批号：1C46K025)、碱性橙22(德国CNW试剂有限公司, 批号：6A16G050)、酸性红73(TCI试剂有限公司,BTGGK-PG，批号：KC5KA-05)、诱惑红[国家标准物质中心，GBW(E)100164，1 mg·mL-1，批号：20140116]、赤藓红[国家标准物质中心，GBW(E)100164，1 mg·mL-1，批号：20140101]、胭脂红[国家标准物质中心，GBW(E)100004a，0.5 mL，批号：20131213]、苋菜红[国家标准物质中心，GBW(E)100002a，0.5 mg·mL-1，批号：20140101]、苏丹红Ⅰ(农业部环境保护科研监测所，SB05-266-2012，1 mg·mL-1，批号：20131205)、苏丹红Ⅱ(农业部环境保护科研监测所，SB05-267-2012，1 mg·mL-1，批号：20131205)、苏丹红Ⅲ(农业部环境保护科研监测所，SB05-268-2012，1 mg·mL-1，批号：20131211)、苏丹红Ⅳ(农业部环境保护科研监测所，SB05-269-2012，1 mg·mL-1，批号：20131130)、新品红(国家药品标准物质，批号：111955-201301)、808猩红(国家药品标准物质，批号：111940-201201)。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 药材 朱砂、西红花、丹参、血竭均为市售。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)； 流动相:A为0.02 mol·L-1醋酸铵溶液，B 为甲醇，梯度洗脱程序： 0～6 min，A：90%～70%；～15 min，A ：70%～55%；～45 min，A ：55%～40%；～60 min，A：40%～10%；～90 min，A:10%。流速:1.0 mL·min-1，柱温 ：35 ℃，DAD检测器扫描范围:210～650 nm，进样量:10 μL，理论板数按金橙Ⅱ计应不低于5 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取金橙Ⅰ、酸性橙Ⅱ、金橙Ⅳ、金橙G、甲基橙、罗丹明B、碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22及酸性红73 对照品适量，加甲醇溶解并定容，制成含1.173 mg·mL-1金橙Ⅰ 、1.218 mg·mL-1酸性橙Ⅱ、1.161 mg·mL-1金橙Ⅳ、1.015 mg·mL-1金橙G、1.342 mg·mL-1甲基橙、1.005 mg·mL-1罗丹明B、1.390 mg·mL-1碱性橙2、1.056 mg·mL-1碱性橙21、1.165 mg·mL-1碱性橙22及5.36 mg·mL-1酸性红73的对照品溶液；精密量取上述各溶液1 ml置50 mL量瓶中，再分取诱惑红、赤藓红、胭脂红、苋菜红对照品溶液及苏丹红Ⅰ～Ⅳ对照品溶液1 mL置于同一量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定药材粗粉2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称定质量，超声处理( 功率250 W，频率100 kHz) 20 min,放冷至室温，再称定质量，用70% 甲醇补足减失的质量，摇匀，用孔径0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 专属性考察 精密量取混合对照品储备液1 μL,进样分析，结果见图1。供试品溶液中各待测成分色谱峰的分离度均>1.5，方法专属性良好。酸性橙Ⅱ与赤藓红保留时间较为接近，但不同波长下两峰的吸光度具有较大差异，可同时结合紫外吸收光谱进行鉴别。

1.苋菜红； 2.胭脂红； 3.金橙G；4.诱惑红； 5.金橙Ⅰ； 6.甲基橙；7.新品红；8.金橙Ⅳ；9.碱性橙2； 10.酸性红73；11.酸性橙Ⅱ； 12.赤藓红； 13.碱性橙21； 14.碱性橙22；15.罗丹明B；16.苏丹红Ⅰ；17.808猩红； 18.苏丹红Ⅱ；19.苏丹红Ⅲ； 20.苏丹红Ⅳ

图1 混合标准品在波长500 nm处的色谱图

1.amaranth； 2.carmine； 3.orange G； 4.allura red AC；5.orangeⅠ； 6.methyl orange； 7.new fuchsin； 8.orange Ⅳ； 9.basic orange 2；10.acid red 73； 11.orangeⅡ sodium salt； 12.erythrosin B sodium salt；13.basic orange 21； 14.basic orange 22；15.rhodamine B； 16.SudanhongⅠ；17.808 scarlet；18.SudanhongⅡ；19.SudanhongⅢ； 20.SudanhongⅣ

Fig.1 Chromatogram of mixed standard at 500 nm

2.4 各色素对照品的紫外吸收光谱 取“2.2.1”项的各色素对照品溶液，分别进样，记录下各色素的紫外吸收光谱，结果20种色素的最大吸收波长各不相同，波长范围456～548 nm。

2.5 样品测定 取各批次市售朱砂、西红花、丹参、血竭药材按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，每批平行2次，各进样10 μL，记录色谱图，并与图1进行对比，若发现与混合标准溶液在相同保留时间下有明显的色谱峰，再与该保留时间下的色素对应的紫外吸收光谱进行对比，若二者峰型与最大吸收波长均一致则可认定该样品中含有该色素。结果发现市售西红花、朱砂某批次中检出酸性橙Ⅱ及808猩红。见图2。

1.酸性橙Ⅱ；2.808猩红

图2 市售西红花、朱砂某批次中检出的酸性橙Ⅱ及808猩红色谱图

1.orangeⅡ sodium salt；2.808 scarlet

Fig.2 Chromatogram of orange Ⅱ sodium salt and 808 scarlet in one batch ofCrocistigmaandCinnabaris

3 讨论

色谱条件中，本实验考察了几种常用的C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(Phenomenex Gemini C18、Thermo ODS HYPERRSIL、Agilent TC-C18、Agilent SB-C18、Waters-Symmetry C18)对20种色素的分离效能，发现在相同的洗脱条件和柱温下，Agilent TC-C18可使20种色素全部达到基线分离，且峰形良好。同时还比较了甲醇-水、甲醇-0.02 mol·L-1醋酸铵溶液甲醇-磷酸溶液洗脱系统，结果表明以甲醇-0.02 mol·L-1醋酸铵溶液洗脱系统分离效果最好。在测定波长范围的选择上，由于各色素的最大吸收波长明显不同，故尽可能选择更宽的测定波长范围，利于采集紫外吸收光谱进行对比分析。

样品处理过程中，由于检测的20种人工合成色素均为水溶性或醇溶性色素，且染色剂都染色在饮片的表面[5]，参照《药品检验补充检验方法和检验项目批

准文件(西红花)》中检查项下的样品处理方法，并比较了乙醇、甲醇、水3种提取溶媒及其不同比例的溶液，结果表明70%甲醇提取率最高，且色谱图中峰型最佳。以70%甲醇为提取溶媒，比较了3种不同的提取方法：加热提取法、微波提取法、超声提取法，结果超声提取法操作简便，提取率略高于前两种提取方法；采用超声提取法，分别考察了加入70%甲醇10，20，30 mL的提取效果，结果表明70%甲醇20，30 mL色素提取量无差异，故选择70%甲醇20 mL进行提取；采用超声法，加入70%甲醇20 mL，又分别考察了提取10，15，20，25，30，40 min的提取效果，结果表明多数品种20 min后，延长提取时间，提取量无差异，且容易提取出检测色素外的其他成分，故选择20 min。

从检验结果来看，红色系药材存在着少许染色现象，使用色素品种以色泽鲜红、价格便宜、易着色的红色系色素为主，因此建议相关部门增加红色系药材中的色素检验项目。

本实验主要以保留时间结合待测物的紫外吸收光谱对药材中非法添加的色素进行检验，但由于色素品种繁多、药材中其他成分易干扰等原因，未能建立相关的含量测定方法，有待结合检验结果的实际意义进一步研究。

[1] 邹耀华,殷红妹,郭怡飚，等.HPLC-PDA法检测西红花和红花中十一种非法添加色素[J].中国卫生检验杂志, 2010, 20 (11) :2724-2725.

[2] 马长宏,单作刚,齐家炜，等.中药染色掺假的研究进展[J].亚太传统医药,2011,7(2):153-154.

[3] 胡浩彬.当前中药材和中药饮片三大制假方法分析[J].药学与临床研究，2012, 20(3) :261-263.

[4] 陈驰.基于液相色谱-飞行时间质谱建立食品中着色剂筛查方法的研究[D].福州：福建农林大学，2012：4-5.

[5] 郑娟，邹耀华.HPLC-PDA法检测蒲黄和黄连中十种非法添加色素[J].中国卫生检验杂志, 2011, 21 (5) :1078-1082.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.023

Simultaneous Determination of 20 Pigments in Illegally Dyed Chinese Herbs by HPLC-DAD

LI Qiyan1,3，ZHU Riran2,SUN Ping2,JIANG Guoping1

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China；2.DepartmentofPharmacy,AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China；3.ShandongInstituteforFoodandDrugControl，Jinan250101,China)

Objective To develop a HPLC-DAD method for the simultaneous determination of 20 synthetic pigments in dyed Traditional Chinese Medicine. Methods The samples were extracted with ultrasonic by 70% methanol, separated on a Agilent TC-C18column (4.6 mm×250 mm，5 μm) by gradient elution using a mobile phase made up of methanol and 0.02 mol·L-1ammonium acetate, and detected at 210-650 nm.The retention times and ultraviolet absorption spectrums were used to test and verify. Results The twenty red and orange synthetic pigments were separated and detected.Orange Ⅱ sodium salt and 808 scarlet were detected in some batch ofCrocistigmaandCinnabaris. Conclusion The method is simple, rapid, accurate, repeatable for determining twenty synthetic pigments in dyed Traditional Chinese Medicine.

Chinese herbs, dyed; Detection, high performance liquid chromatography-diode array ; Detection of pigment; Pigment, synthetic;Cinnabaris; Orange Ⅱ sodium salt

2014-07-07

2014-10-20

*山东省中医药科学技术研究项目(2013-084)

李启艳(1978-)，女，山东烟台人，副主任药师，硕士，研究方向：中药质量标准。电话：(0)15253118118，E-mail:15253118118@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0655-03