PP4R1抑制甲状腺癌SW579细胞增殖的研究

李馨筱

(四川大学华西医院甲状乳腺外科，四川 成都 610041)

PP4R1抑制甲状腺癌SW579细胞增殖的研究

李馨筱

(四川大学华西医院甲状乳腺外科，四川 成都 610041)

目的 探讨甲状腺癌细胞株SW579中PP4R1对细胞增殖能力的影响。方法 利用慢病毒完成甲状腺癌细胞SW579/pCDH1-Con和SW579/pCDH1-PP4R1的建株，采用Western blot和qRT-PCR技术检测PP4R1表达变化；体外用CKK-8法检测SW579细胞增殖的变化；流式细胞仪检测SW579细胞周期的变化；克隆形成实验检测两组克隆形成率的变化。结果 PP4R1过表达慢病毒感染甲状腺癌SW579细胞系构建成功；在体外实验中，过表达PP4R1可抑制细胞增殖，将细胞周期阻滞于S期，从而抑制甲状腺肿瘤的生长。结论 PP4R1在甲状腺癌的发生发展中起着重要作用，其是否能作为甲状腺癌新的靶向分子仍有待进一步的研究。

PP4R1；甲状腺癌；增殖

甲状腺癌占头颈部癌症的1/3，是内分泌系统中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近年来，甲状腺癌的发病率显著增高，已经成为发病率增长最快的恶性肿瘤之一[1]。据统计，美国2010年有33930例女性和10740例男性被诊断为甲状腺癌，其中1690例患者死亡[2]。甲状腺癌中分化较好的乳头状癌占80%，其10年生存率为90%，然而有超过10%的人会复发，且TNM分期III期和IV期的甲状腺癌仍然有20%～30%的死亡率[3]。晚期或是复发的患者，再行治疗预后较差，甚至有部分患者己不能通过手术治疗。深入探讨甲状腺癌发生与发展的机制，寻找治疗晚期及复发患者的新方法成为目前的迫切需求。PP4R1是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶4(protein serine/threonine phosphatase 4，PP4)的一个亚基[4]。PP4全酶由催化亚基PP4C以及调节亚基PP4R1和PP4R2、PP4R3组成，是PP2A家族的一个重要成员，它参与调节许多重要的细胞进程，如中心体成熟、DNA修复、细胞应激以及包括NF-κB、JNK等信号通路的调节[5～7]。PP4R1作为PP4全酶的一部分，并不参与该酶的催化，而是作为另一个亚基，PP4c亚基的伴侣亚基，起调节作用。因此，虽然早在1999年就已发现了这个基因，但是并没有引起学界的重视。本课题拟通过siRNA技术上调甲状腺癌SW579细胞中PP4R1表达，体外实验检测肿瘤细胞增殖能力变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人甲状腺癌细胞SW579购自于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。PP4R1、β-actin的引物合成于上海生工生物工程有限公司。RNA Trizol购于Invitrogen公司。PrimerScript RT reagent Kit、SYBR Premix EX TagTM试剂购于TAKARA公司。小鼠抗人单克隆抗体PP4R1、β-actin以及羊抗鼠二抗购于Santa Cruz公司。Negative control ShRNA以及特异性过表达PP4R1的shRNA序列由上海吉凯公司合成。Matrigel胶购于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒完成甲状腺癌细胞SW579/pCDH1-Con和SW579/pCDH1-PP4R1的建株 慢病毒表达载体与瞬间表达载体相比，其可以可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞如原代细胞、悬浮细胞等，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，是制备稳定表达目的基因细胞株和进行体内实验的有效手段。本项目中拟构建对照重组空病毒pCDH1-Con和重组慢病毒pCDH1-PP4R1，感染SW579甲状腺癌细胞，建立甲状腺癌细胞SW579/pCDH1-Con和SW579/pCDH1-PP4R1细胞系。

1.2.2 定量实时荧光PCR(qRT-PCR)检测PP4R1的mRNA表达 引物由上海生工生物公司合成。转染后48小时收集细胞，按Trizol试剂说明书提取总RNA，经PrimeScript RT reagent Kit合成cDNA。然后使用SYBR Premix EXTaqTM试剂，进行荧光PCR定量检测。反应条件为：预变性94 ℃ 3 s，变性94 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，共40个循环。Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环，空白对照组与实验组及阴性对照组的比较以PP4R1荧光定量结果的Ct值减去β-actin的Ct值得△Ct，以空白对照组RNA的△Ct作为矫正数，计算2-ΔΔCt值，以2-ΔΔCt值为PP4R1基因的相对表达量。

1.2.3 蛋白质印迹法(western blot)分析 用RIPA和PMSF提取转染48 h的各组培养细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。经12%SDS-PAGE胶电泳后转膜，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜。次日加二抗37 ℃温育1 h，ECL发光液显色。以β-actin为内参。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖能力 正常和感染了病毒的SW579细胞分别混悬，按5×103个/孔接种于96孔板。分别于培养后1、2、3、4、5天为检测点。每次检测前，在培液中每孔加入10 μl CCK-8试剂，37 ℃温箱孵育2 h，然后用酶标仪检测450 nm处吸光度值。吸光度代表细胞增殖情况。

1.2.5 克隆形成实验 将上述稳转细胞消化后以400个接种至6孔板摇匀培养，每3天换次培养基，培养2～3周，观察克隆形成，当细胞形成肉眼可见的细胞时停止培养，弃去培养基，进行吉姆萨染色，染色后进行计算克隆数。

1.2.6 细胞周期测定 把稳定表达pCDH1-PP4R1和pCDH1-Con的甲状腺癌细胞株种植在直径6 cm培养皿上，待细胞长致70%时消化收集细胞，用70%酒精-20 ℃过夜固定，然后用碘化丙啶(Propidium Iodide)(Molecular Probes)和 1 mg/ml核糖核酸酶A 室温 30分钟处理。细胞周期通过FACS Caliber 系统(Becton Dickinson，Bedford，MA)来分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 15.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒制备与高效感染SW579甲状腺癌细胞

感染了特异性干扰PP4R1质粒的慢病毒后，成功地过表达了SW579细胞内的PP4R1含量，稳定过表达PP4R1的甲状腺癌细胞株SW579的构建成功(图1)。

2.2 过表达PP4R1基因对甲状腺癌细胞增殖和细胞周期影响 通过慢病毒感染甲状腺癌细胞SW579来转入PP4R1基因，比较上调PP4R1对甲状腺癌细胞增殖、周期的影响。CCK-8实验结果表明，PP4R1基因上调后SW579细胞的增殖减慢，PI染色流式细胞仪检测发现，细胞周期发生明显改变，G2/M期细胞降低，G0/G1、S期细胞增加(图2)。

2.3 过表达PP4R1基因对甲状腺癌细胞克隆的影响 过表达PP4R1基因表达可以显著降低SW579细胞的克隆形成，克隆数明显减少(图3)。

3 讨论

随着分子生物学和甲状腺癌研究的不断深入，相关基因与甲状腺癌的发生、发展及转归也逐渐成为研究执点，也取得了一系列的进展。目前甲状腺癌的分子靶点主要涉及到酪氨酸激酶受体RET蛋白和NTRK1蛋白，G蛋白H-RAS、K-RAS和N-RAS，信号调节激酶丝/苏氨酸特异性激酶B-RAF、磷脂酰肌醇3-激酶PI3K和AKT1等[8]。目前有望成为甲状腺癌分子靶向治疗的药物主要有小分子酪氨酸激酶抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂和血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂等，包括索拉非尼、舒尼替尼、凡德他尼、莫替沙尼、吉非替尼，越来越多的甲状腺癌分子靶向药物进入临床实验期，为甲状腺癌患者带来福音。

图1 PP4R1过表达慢病毒感染甲状腺癌SW579细胞系 a：荧光显微镜下观察PP4R1慢病毒和对照病毒感染的SW579细胞，病毒感染效率达90%；b：qPCR分析慢病毒感染后PP4R1 mRNA的表达；c：免疫印记分析慢病毒感染后PP4R1蛋白的表达

图2 转入PP4R1基因前后SW579细胞增殖及细胞周期的改变

图3 克隆形成实验检测过表达PP4R1后 SW579细胞的克隆数

黄秀清等报道了PP4能够通过PP4R1与HDAC3(Histone deacetylase 3，组蛋白去乙酰化酶)产生相互作用，从而调节HDAC3 Ser424的去磷酸化，抑制HDAC3的活性，使得肿瘤耐药细胞恢复药物敏感性[9]。近期，Berchmann等发现在T淋巴细胞中，PP4R1作为PP4全酶的一部分，桥接NF-κB激酶抑制剂(IKK)复合物和磷酸酶PP4c，从而引导PP4c的去磷酸化活性和IKK复合物的失活，人初级T淋巴细胞的活化和增殖可以引发PP4R1的表达。PP4R1表达不足可以引起IKK活性持续和增强、T细胞过度活化以及出现异常NF-κB信号，过表达PP4R1则NF-κB信号降低。进一步研究发现PP4R1在T细胞淋巴瘤细胞株中低表达，在一株来源于Sézary综合征患者的淋巴瘤细胞株中，PP4R1几乎不表达，PP4R1桥接了NF-κB激酶抑制剂(IKK)复合物和磷酸酶PP4c，当PP4R1表达量下降时，IKK复合物与PP4c分离，从而激活NF-κB信号通路[10]。以上相关研究表明PP4R1很可能是一个重要的抑癌基因，其刚引起人们的关注，仅见其在T细胞淋巴瘤中的报道，在甲状腺癌中的功能及其对甲状腺癌进展的影响尚未有文献报道。

为了证实PP4R1对甲状腺癌发生与发展的影响，我们在本研究中证实，在甲状腺癌细胞株SW579中，转入PP4R1基因，细胞的增殖能力明显受限，到第5天时，实验组约为对照组细胞数目的2/3(P< 0.05)。进一步的克隆形成实验提示，细胞的生长和增殖能力明显受到抑制。细胞周期实验提示，过表达PP4R1能够降低G2/M期的细胞。我们的研究提示PP4R1有抑制肿瘤形成的功能，这表明PP4R1的缺失在甲状腺癌的发生与发展阶段发挥重要的作用。

PP4R1在甲状腺癌中的调节机制还不清楚。现有研究显示，其功能很可能与HDAC3密切相关，也有研究报道了其功能与NF-κB信号通路相关。因此，进一步研究PP4R1抑制甲状腺癌发生发展的机制将有利于为甲状腺癌的防治提供新的思路。

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PP4R1 can suppress the proliferation of SW579 thyroid cancer cells in vitro

LIXin-xiao

(DepartmentofBreastandThyroidSurgery，WestChinaHospitalofSichuanUniversity，Chengdu610041，China)

Objective To investigate the effect of protein serine/threonine phosphatase 4 regulatory subunit 1(PP4R1)on proliferation of SW579 thyroid cancer cells.Methods Thyroid cancer cells SW579/PCDH1-Con and SW579/pCDH1-PP4R1 were built by Centivirus imfection.The expression levels of the enzyme in SW579 cells were examined by using Western blot and qRT-PCR analyses.The changes of the cell proliferation were determined by using a CCK-8 assay.The changes of the cell cycle were detected by using a flow cytometry while a clone formation assay was used to observe the change in the clone formation rate.Results SW579 cell line that was infected with PP4R1 over-expression Lentivirus was successfully constructed.In in vitro experiments，over-expressed PP4R1 could inhibit the proliferation of SW579 cells and arrest the cell cycle at S phase，thus inhibit thyroid tumor growth.Conclusion PP4R1 may play an important role in thyroid cancer development.However，further studies are needed to determine whether it can be used as a novel therapeutic target for treatment of the cancer.

PP4R1；Thyroid cancer；Proliferation

R736.1

A

1672-6170(2015)03-0021-04

2014-10-28；

2015-01-20)