一株抑制拟南芥生长的真菌的鉴定

田长恩，周玉萍，陈琼华，黄小玲，黄章科

（广州大学a.生命科学学院；b.植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室，广东广州 510006）

一株抑制拟南芥生长的真菌的鉴定

田长恩，周玉萍，陈琼华，黄小玲，黄章科

（广州大学a.生命科学学院；b.植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室，广东广州 510006）

报道了一种在拟南芥种植介质泥炭土上滋生且明显抑制拟南芥（Arabidopsis thaliana）生长的黄褐色霉状真菌；并通过形态特征观察，将该菌初步鉴定为黄色疣枝孢菌（Chromelosporium fulvum）；进一步通过rDNA的ITS序列测序和比对分析，将其鉴定为黄色疣枝孢菌.该真菌种是广东省新记录种，且该菌抑制拟南芥的生长未见报道.

黄色疣枝孢菌；拟南芥；生长抑制；泥炭土

疣枝孢菌属（Chromelosporium）由CORDA于1833年建立，隶属于盘菌目（Pezizales）盘菌科（Pezizaceae），在真菌索引网站（Index Fungorum，http：／／www.indexfungorum.org／Names／Names.asp）共记录有11个种.黄色疣枝孢菌［Ch．fulvum］是该属的一种，首先在用于温室植物栽培的泥炭土上发现，因而被称为泥炭霉［1］，可导致十字花科植物甘蓝（Brassica oleracea var.capitata）发生病害［2］.

本研究组在培养室种植模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）时发现，培养用基质——泥炭土表面长满一种黄褐色霉，抑制拟南芥的生长.因此，对该真菌进行了形态鉴定和rDNA ITS序列分析，明确了其分类地位，将其鉴定为Chromelosporium fulvum，为广东省的新记录种.

1 材料与方法

1.1 菌种

菌株源于本课题组所用的种植拟南芥的泥炭土（TREF，荷兰），经分离纯化后保存于广州大学生命科学学院微生物实验室.

1.2 主要试剂及仪器

Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒和Taq酶，Takara公司产品；其它试剂均为国产分析纯；PCR仪，德国Eppendorf公司；核酸蛋白分析仪，美国BECKMAN公司DU800；低温高速离心机，美国Beckam Coulter AllegraTM X-22R；常温高速离心机，美国Beckam Coulter Microfuge®18；核酸蛋白分析仪，美国Beckam Coulter DU®800；电子天平，瑞士Precisa XS 365M和XT 120A；酸度计，上海宇隆PHS-3C；电热恒温水槽，上海森信DKB-600A；全温振荡器，哈尔滨东联技术开发有限公司.

1.3 培养基及培养条件

培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，硫酸镁1.5 g，磷酸二氢钾3 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0.

培养条件：28℃，遮光培养3～5 d.

1.4 菌株的形态学与分子鉴定

1.4.1 菌株的形态学鉴定

依据植物及大型真菌的菌斑种类形态鉴定程序MS（i）／C015-C01《真菌鉴定手册》［3］进行形态学鉴定.

1.4.2 菌株的分子鉴定

基因组DNA的提取采用CTAB法［4］.菌株rDNA ITS区段的PCR扩增：扩增引物为ITS-F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACA-3′和ITS-R：5′-CCTACCTGATCTGAGGTCA-3′.PCR反应体系（50 μL）包括10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 1 μL、DNA模板1 μL、引物各1 μL、Taq酶0.5 μL、MgCl25μL、ddH2O 35.5 μL.反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸7 min.PCR产物先经琼脂糖凝胶电泳分离，然后用凝胶NDA回收试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）纯化后与pMD-18T（TaKaRa）载体连接，转化大肠杆菌DH-5α，选取阳性克隆送上海生物工程公司测序，测序结果提交至GenBank进行Blast同源序列搜索，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC等国际菌种保藏中心的菌株.

1.5 拟南芥的种植与生长观测

将野生型拟南芥（colombia生态型）的种子浸泡于蒸馏水中，在4℃冰箱放置48 h后，点种在泥炭土（TREF，荷兰）上，置于温度22±1℃、16 h光照和8 h黑暗的培养室内培养，定期浇水与施肥.将泥炭土在高压灭菌锅中经121℃处理30 min，获得无真菌基质.

生长观测：用直尺测量4周苗龄植株的叶片长度和宽度；用天平（Precisa-XT 120A）称量植株的鲜重.每处理随机统计5个植株，实验重复3次.

2 结果与分析

2.1 菌株的发现

本实验室长期从事拟南芥基因功能的研究工作，需要种植拟南芥.从2009年8月起，发现用于栽培的泥炭土表面经常滋生一种黄褐色的霉状真菌（图1C）.图1所示的有、无真菌泥炭土上的植物的照片为同时播种、相同管理、同时拍摄而得.无真菌基质是将泥炭土在高压灭菌锅中经121℃处理30 min所得；有真菌基质为未经高压灭菌的市场购回的泥炭土.比较有、无真菌泥炭土上的植物的长势，不难发现，真菌的滋生，明显地抑制了拟南芥的生长（图1B）.此外，对4周苗龄植株的叶片长度和宽度以及植株的鲜重的观测结果（表1）进一步说明真菌的滋生，显著地抑制了拟南芥的生长.

图1 抑制拟南芥生长的黄褐色霉状真菌菌株Fig.1 The yellow-brown mold-like fungal strain inhibiting Arabidopsis thaliana growth

表1 真菌滋生对拟南芥生长的影响Table 1 Effect of the growing fungal strain on growth of Arabidopsis thaliana

为了控制该菌的蔓延，有必要弄清该菌株的分类地位.于是，就从培养基质——泥炭土中分离出相应菌株，进行形态学和分子生物学鉴定.

2.2 菌株的形态学鉴定

依据植物及大型真菌的菌斑种类形态鉴定程序［3］进行形态学鉴定.菌落在PDA培养基中呈流状，丝绒状至丛毛状，初期白色或淡黄色，后呈浅赭黄色或棕土色.菌丝纤细，宽9.80～22.10 μm，多数为匍匐状，但有些是松散的交织成网状（图2A，图2B），透明（图2A，箭头所指）至淡黄褐色（图2A，三角形所指），具分枝，有隔.分生孢子梗直立或分枝，单生或群居，有时在菌丝顶端出现二叉分枝；初期透明，后期会渐变成浅棕色，光滑，有隔膜.产孢细胞圆柱状至棍棒状，具细齿.分生孢子单个，顶侧生，通常单个分生孢子无色透明（图2C，箭头所指）；当聚在一起时有色，球形，光滑（图2D）；孢子直径4.90～7.84 μm.

上述宏观特征和显微特征符合黄色疣枝孢菌（Chromelosporium fulvum）种的特征范围.

图2 抑制拟南芥生长的真菌菌株的形态学观察Fig.2 Observation for the fungal strain inhibiting Arabidopsis thaliana growth

2.3 菌株的分子鉴定

以该菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增获得一段长度为606 bp的rDNA片段，序列结果见图3（下划线区域的序列为引物）.

将该序列在GenBank数据库中进行Blastn搜索，得到一系列同源性较高的ITS序列.其中，与GenBank连接号为HQ29059.1的ITS区段同源性最高，606个碱基中没有任何差异，序列相似性为100%（表2）.RENSKE等［5］认为，通过ITS区域比对，序列相似性≥99%的真菌可鉴定为同一个种. GenBank接收号为HQ29059.1的序列源于黄色疣枝孢菌Ch．fulvum，因此，可以确定该菌株为黄色疣枝孢菌Ch．fulvum.

可见，从形态特征上对目标菌株所鉴定的种名与基于ITS序列、通过GenBank数据库检索所得到的最相似物种完全一致.

图3 目标菌株的rDNA序列Fig.3 The rDNA sequence of the strain

表2 目标菌株的ITS序列与其他已知IST序列的比对Table 2 Alignment of the rDNA sequence of the strain to other known IST sequences

3 讨 论

1975年，HENNEBERT等在用于温室植物栽培的泥炭土上发现了真菌Ch．ollare，称之为泥炭霉［1］.1977年，KILPATRICK发现“另一种”泥炭霉Ch．fulvum可导致十字花科植物甘蓝发生病害［2］. 1985年，COETZEE等根据国际命名法规将病菌泥炭霉命名为黄色疣枝孢菌（Ch．fulvum），并将Ch．ollare归为此菌［6］.截至目前，黄色疣枝孢菌已在北美［1］、欧洲［2，6］、南非［7］、中国的台湾［8］和山东［9］等地相继被发现.

拟南芥属十字花科植物，是植物生物学研究的模式植物，主要在培养室种植，可用泥炭土作为栽培介质.本研究组在拟南芥的栽培过程中发现，1种黄褐色的霉菌的滋生能非常明显的抑制拟南芥的生长（图1，表1）.继而分离该菌株，并以传统的形态学特征为依据，同时采用rDNA ITS序列的比较分析等分子生物学手段（图2～图4和表2），对霉菌进行了分类鉴定，确定该菌株为黄色疣枝孢菌.经查实，该真菌是广东省新记录种.就笔者所知，黄色疣枝孢菌抑制拟南芥生长未见报道.

本实验室所用的泥炭土是由荷兰进口的TREF品牌，黄色疣枝孢菌的滋生可能是对泥炭土的消毒灭菌不彻底所导致的结果.既然能导致十字花科植物甘蓝发生病害［2］，那么黄色疣枝孢菌抑制同科植物拟南芥的生长就是完全可能的.

［1］ HENNEBERT G L，KORF R P.The peat mould，Chromelosporium ollare，conidial state of Peziza ostracoderma，and its misapplied names，Botrytis crystallina，B．spectabilis，Ostracoderma epigaeum and Peziza atrovinosa［J］.Mycologia，1975，67：214-240.

［2］ KILPATRICK R A.Symptoms and control of the peat mold，Chromelosporium fulvum，on Crambe abyssinica［J］.Plant Disease Rep，1977，61：93-95.

［3］ 曾大兴.适于RAPD分析的真菌DNA提取方法［J］.生物技术，2003，13（2）：20-21. ZENG D X.A method of DNA extraction for RAPD analysis in fungi［J］.Biotechno logy， 2003，13（2）：20-21.

［4］ 魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979. WEI J C.Handbook for fungi identification［M］.Shanghai：Shanghai Sci＆Tech Press，1979.

［5］ RENSKE L，PAULA L，THANW K，et al.Molecular identification of Ectomycorrhizalm ycelium in soil horizons［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69（1）：327-333.

［6］ COETZEE J C，EICKER A.Chromelosporium fulvum，the correct name for the anamorph of the peat mould［J］.Phytophylactica，1985，17（3）：173.

［7］ COETZEE J C，EICKER A.Chromelosporium ollare reported in South Africa［J］.Phytophylactica，1983，15：11-12.

［8］ TSENG H Y，CHEN Z C.Materials for the fungal flora of Taiwan（1）［J］.Tran Mycol Soc Rep China，1987，2（1）：65-72.

［9］ 金静，王远路，李桂舫，等.壳皮盘菌2个无性型的报道［J］.菌物研究，2008，6（2）：67-69. JIN J，WANG Y L，LI G F，et al.Two anamorphic taxa of Peziza ostracoderma［J］.J Fung Res，2008，6（2）：67-69.

Identification of a fungal strain which inhibits Arabidopsis thaliana growth

TIAN Chang-en，ZHOU Yu-ping，CHEN Qiong-hua，HUANG Xiao-ling，HUANG Zhang-ke
（a.School of Life Sciences；b.Guangzhou Key Laboratory for Functional Study on Stress-Resistant Genes in Plants，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）

Firstly，a yellow-brown mold-like fungal species which propagated in the cultivation media peat and inhibited Arabidopsis thaliana growth was found in our laboratory.Then，the species was preliminarily distinguished as Chromelosporium fulvum（Link）McGinty based on its morphological characters.At last，through sequencing and alignment to other known IST sequences of rNDA，this strain was again identified as Ch．fulvum（Link）McGinty.This fungal species is a new record in Guangdong Province，China.To our knowledge，this is the first report for Ch．fulvum to inhibit A．thaliana growth.

Chromelosporium fulvum；Arabidopsis thaliana；growth inhibition；peat

Q 949.32

A

【责任编辑：周 全】

1671-4229（2015）01-0039-04

2014－09－24；

2014－12－14

国家自然科学基金资助项目（31170204，31470014）；羊城学者科研资助项目（12A001G）

田长恩（1964－），男，教授，博士.E-mail：changentian＠aliyun.com