布洛芬对兔骨关节炎模型Wnt/β-catenin信号通路和软骨细胞基质代谢的影响

刘洪彦，郑 毅

(首都医科大学附属北京朝阳医院风湿免疫科，北京 100020)

布洛芬对兔骨关节炎模型Wnt/β-catenin信号通路和软骨细胞基质代谢的影响

刘洪彦，郑 毅

(首都医科大学附属北京朝阳医院风湿免疫科，北京 100020)

目的 探讨布洛芬对兔骨关节炎(osteoarthritis，OA)模型膝关节软骨细胞基质代谢及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 采用改良伸直位固定法制作兔OA模型，分离提取兔OA模型膝关节软骨细胞进行培养。采用四唑盐比色法选择布洛芬和二甲基亚砜(DMSO)实验浓度。确定实验浓度后将软骨细胞分为DMSO组和布洛芬组，分别给予1%DMSO和250 μM布洛芬干预48 h后，采用real-time PCR法和ELISA方法检测软骨细胞Wnt/β-catenin相关因子(β-catenin、MMP-13、ADAMTS-4、II型胶原和蛋白聚糖)mRNA及蛋白的水平。结果 DMSO对照组和布洛芬组β-catenin、MMP-13、ADAMTS-4、II型胶原和蛋白聚糖的mRNA及蛋白水平比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)。结论 兔OA模型膝关节软骨细胞中，布洛芬对Wnt/β-catenin信号通路和软骨细胞基质代谢无明显影响。

骨关节炎；Wnt/β-catenin信号通路；基质代谢；布洛芬

骨关节炎是(osteoarthritis，OA)是一种由多种原因所致的慢性退行性关节病变。研究显示，Wnt/β-catenin信号通路是参与骨和软骨代谢的重要信号通路，在OA中发挥重要作用。另有研究显示，非甾体类抗炎药(NSAIDs)可通过抑制Wnt信号通路发挥抗肿瘤作用，而此通路下游基因和蛋白表达可影响关节软骨生长代谢，在OA发生发展中有重要作用[1，2]。据此提出假设，在OA中，NSAIDs可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对OA软骨细胞代谢发挥作用。为验证此假说，本研究以布洛芬为例进行了相关研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 6月龄健康普通级新西兰大耳兔8只(北京房山动物养殖厂提供)，雄性，体重2～2.5 kg，复合饲料喂养。DMEM-F12细胞培养液，Hyclone公司；胎牛血清，元亨生物公司；TRIZOL，Invitrogen life technologies公司；RNAsimple总RNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；cDNA合成反转录试剂盒，加拿大MBI Fermentas公司；SYBR Green PCR Master Mix，美国Applied Biosystems公司；ELISA试剂盒，武汉华美。一抗和二抗，北京博奥森生物有限公司。

1.2 细胞准备 适应性喂养1周后，采用改良伸直位固定法[3]制作兔OA模型，造模7周。造模完成后处死家兔，无菌条件下取造模膝关节软骨组织，应用分阶段酶消化法分离软骨细胞，用含20%FBS的DMEM-F12，37 ℃，5% CO2进行培养。

1.3 药物浓度选择 取生长良好的第二代OA软骨细胞，分为正常对照组、DMSO组和布洛芬组。正常对照组不予处理，DMSO和布洛芬组设置高中低三种药物浓度梯度，分别为DMSO 1%、0.1%与0.01%，布洛芬1000、500、250 μM，参照试剂盒说明书，应用四唑盐(MTT)比色法检测各浓度梯度内对兔OA软骨细胞活性的影响。取不同兔的第二代软骨细胞重复上述实验1次，计算2次实验中每种药物浓度组光吸收值的平均值。

与正常对照组(0.162±0.014)相比，高浓度和中浓度布洛芬组光吸收值(OD值)明显降低(P< 0.05)，而不同浓度DMSO组与对照组差异无统计学意义(P> 0.05)，结果见表1。参考文献，选择对细胞无明显毒性作用并与血药浓度相近的较高药物浓度进行药物干预实验。故最终选择布洛芬250 μM和DMSO 1%为实验浓度。

表1 布洛芬对骨关节炎软骨细胞活性的影响

*与对照组相比，P< 0.05

1.4 ELISA方法检测蛋白水平 将软骨细胞分为DMSO组和布洛芬组。取二代OA软骨细胞进行培养，分别加入选择实验浓度的DMSO和布洛芬培养48 h。取细胞上清液采用ELISA方法检测蛋白水平，具体步骤严格按ELISA说明书进行。

1.5 RT-PCR方法检测基因水平 两组细胞经DMSO和布洛芬干预培养48小时后弃上清液，用PBS清洗2遍后，加入1 ml TRIZOL反复吹打，参照试剂说明书完成RNA提取和逆转录反应。PCR反应引物设计如表2。应用SYBR Green PCR Master Mix在7300型荧光定量PCR仪进行荧光定量RT-PCR，检测各因子mRNA水平。实验中所有样本均设三复孔。反应体系：cDNA 2 μl，Primer 1(10 μM)1 μl，Primer 2(10 μM)1 μl，2×SYBR Green qPCR Mix 5 μl，dd H2O 1 μl。反应条件：50 ℃，2 min； 94 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；60 ℃，1 min 30个循环。获得扩增曲线和溶解曲线。mRNA相对表达量采用2-ΔΔCT进行计算，ΔCT=CT(目的基因)-CT(内参基因)。CT值代表每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

表2 Wnt/β-catenin通路相关因子引物序列

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 布洛芬对兔OA软骨细胞基质代谢的影响 与DMSO组相比，布洛芬组细胞培养上清液中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖蛋白水平差异无统计学意义(P> 0.05)。与DMSO组相比，布洛芬组软骨细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因表达水平差异无统计学意义(P> 0.05)，见表3。

表3 布洛芬对OA软骨细胞上清液中软骨基质蛋白的影响

2.2 两组Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA及蛋白水平的比较

2.2.1 两组β-catenin mRNA及蛋白水平的比较 两组软骨细胞内β-catenin mRNA和β-catenin蛋白水平差异无统计学意义(P> 0.05)(图1)。两组软骨细胞内MMP-13及MMP-13蛋白水平差异无统计学意义(P> 0.05)，见图2。

2.2.2 两组MMP-13 mRNA及蛋白水平的比较

2.2.3 两组ADAMTS-4 mRNA及蛋白水平的比较 两组软骨细胞内ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-4蛋白水平差异无统计学意义(P> 0.05)，见图3。

图1 两组兔OA软骨细胞内β-catenin mRNA和蛋白相对表达量 a：mRNA；b：蛋白水平

图2 两组兔OA软骨细胞内MMP-13 mRNA和蛋白相对表达量 a：mRNA；b：蛋白水平

3 讨论

Wnt/β-catenin信号通路在OA中发挥着重要作用，它与骨组织细胞分化、生长、凋亡、死亡、骨量调节等多个病理生理过程有关[4，5]。研究发现，Wnt/β-catenin通路的异常使骨骼系统代谢失衡，可导致OA的发生[6]，此信号通路靶基因包括参与细胞增殖、凋亡、炎症和基质代谢的基因，其中包括MMPs、ADAMTS等，对OA软骨代谢具有重要作用[7，8]。

图3 两组兔OA软骨细胞ADAMTS-4 mRNA及蛋白相对表达量 a：mRNA；b：蛋白水平

NSAIDs作为缓解OA症状的重要药物，NSAIDs主要作用机制是抑制环氧化酶(cyclooxygenase，COX)活性，减少炎症因子前列腺素的合成，从而减轻或控制炎症反应。根据对COX-1和COX-2的选择性，分为非选择性NSAIDs和选择性NSAIDs，前者同时抑制COX-1和COX-2，而后者更有针对性地抑制COX-2。本实验中研究用药布洛芬属于非选择性COX抑制剂。研究发现，NSAIDs可通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥肿瘤预防作用[9，10]，而其下游靶基因在OA软骨代谢中发挥重要作用。那么，NSAIDs对软骨的作用是否能够通过Wnt/β-catenin来调节，经文献检索，未发现相关文献报道。故本研究从细胞水平探讨布洛芬对软骨细胞基质代谢的作用以及Wnt/β-catenin信号通路在其中可能发挥的作用。

本研究分别采用布洛芬250 、500、1000 μM进行药物毒性实验，结果发现后两者均对OA软骨细胞产生不同程度的毒性作用，故选择布洛芬250 μM为最终浓度。另外，由于所选择的实验用药布洛芬在合成过程中添加了DMSO溶剂，为了排除DMSO对实验的干扰，对DMSO在浓度为0.01%、0.1%和1%时进行细胞活性检测，结果发现各浓度DMSO对OA软骨细胞的活性均无影响。由于药物中DMSO的浓度更接近1%，故以此为对照，以排除后续实验中DMSO的干扰。

本研究发现，经布洛芬干预后，OA软骨细胞内II型胶原和蛋白聚糖无明显变化。提示布洛芬对兔OA软骨基质代谢无明显影响。临床上，布洛芬广泛用于缓解OA疼痛症状。有个别研究显示布洛芬对软骨基质代谢具有抑制作用[11]，这使得临床医生在应用布洛芬治疗OA时产生了迟疑。而本实验发现布洛芬对软骨细胞基质代谢并无抑制作用，为布洛芬治疗OA的临床应用提供了新的理论依据。

本研究结果还发现，经布洛芬干预后，软骨细胞内β-catenin基因和蛋白及其下游因子MMP-13、ADAMTS-4均无明显变化。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键因素。存在Wnt信号时，β-catenin在细胞浆中积累，累积到一定量即进入核内与Lef/Tcf结合可激活下游靶基因转录。β-catenin在细胞浆内水平的高低和核内转移的情况提示了Wnt/β-catenin信号通路的状态。Wnt/β-catenin通路下游因子MMP-13和ADAMTS-4是与软骨基质代谢密切相关的因子，前者主要对软骨基质II型胶原具有促分解作用，而后者主要对蛋白聚糖具有分解作用。此实验中，经布洛芬干预后β-catenin基因和蛋白均无明显变化，其下游因子亦无明显变化，恰与软骨基质II型胶原和蛋白聚糖未发生变化的结果吻合。上述结果均提示，在OA软骨细胞中布洛芬对Wnt/β-catenin信号通路无抑制作用，这与NSAIDs在肿瘤中的研究结果不一致。Greenspan等[12]用布洛芬干预SW480结肠癌细胞后发现，布洛芬可抑制细胞中β-catenin的核内转移，抑制下游靶基因cyclin D1的表达，发挥抗肿瘤作用。而本实验在OA中的研究并未发现布洛芬对Wnt信号通路的抑制作用。Gareddy在人胶质细胞瘤中的研究也发现NSAIDs塞来昔布可通过抑制Wnt信号通路而抑制人胶质细胞瘤的生长。我们认为OA软骨细胞和肿瘤细胞中研究结果出现不一致的原因可能如下：①组织细胞差异性。目前NSAIDs对Wnt信号通路的抑制研究仅局限于肿瘤细胞内，未发现在其它组织或细胞内的相关献报道。肿瘤细胞作为人体内的异常变异的细胞，其在信号通路方面的特殊性可能是导致在OA软骨细胞中研究与肿瘤细胞内研究结果不一致的原因。②COX-2的依赖性。Smith等[13]的研究也发现，紫外线诱导的COX-2表达与PGE2增加导致β-catenin信号通路的激活，最新研究显示[14]COX-2抑制剂的应用可以显著抑制紫外线诱发的β-catenin活化，在NSAIDs通过抑制β-catenin信号通路发挥抗肿瘤作用时，罗非昔布等COX-2特异性抑制剂较COX非特异性抑制剂作用更为显著[15]，上述结果均提示Wnt/β-catenin信号通路是具有COX-2依赖性的。本实验中选择布洛芬为研究药物，它是一种非选择性COX抑制剂，对COX-2的抑制作用较弱，这可能是OA中布洛芬未表现出Wnt/β-catenin信号通路抑制性的原因之一。

综上所述，布洛芬对OA中软骨细胞基质代谢无明显影响，为临床医生应用布洛芬治疗OA提供了进一步的理论依据。另外，布洛芬对Wnt/β-catenin信号通路亦无明显抑制作用，这可能是与NSAIDs对Wnt/信号通路的抑制作用具有COX-2依赖性有关。

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The role of ibuprofen to Wnt signaling pathway and chondrocytes matrix metabolism in osteoarthritis

LIU Hong-yan，ZHENG Yi

(Department of Rheumatology and Immunology，Beijing Chao-yang Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100020，China)

ZHENGYi

Objective To study the metabolism how ibuprofen influence matrix metabolism of rabbit OA chondrocytes and the role of Wnt/β-catenin signaling pathway in this process.Methods Use a modified way of mechanical fixation to make rabbit OA model，separation and extraction of rabbit knee OA chondrocytes and then culture in medium.MTT was used to select the dose of DMSO and ibuprofen.After that，the cultured chondroctyes were divided into nomral control group and ibuprofen group，use ELISA and real-time PCR to detect the protein and gene expression of Wnt/β-catenin signaling pathway related factors including β-catenin，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，collagen II，proteoglycan.Results There were no differences between normal group and ibuprofen group of Wnt/β-catenin signaling pathway related factors including β-catenin，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，collagen II and proteoglycan.Conclusion In rabbit OA knee chondrocytes，ibuprofen has no effect on matrix metabolism and Wnt/β-catenin signaling pathway.

Osteoarthritis； Wnt /β-catenin signaling pathway； Matrix metabolism； Ibuprofen

R593.2

A

1672-6170(2015)05-0057-05

国家自然科学基金资助项目(编号：81172855)

郑 毅，女，主任医师，教授，博士研究生导师。中华医学会风湿病分会委员，中国医师协会风湿免疫科医师分会常务委员，中国医师协会内科培训专业指导委员会主任委员，海峡两岸医药卫生交流协会风湿病专家委员会副主任委员，北京医学会风湿病分会副主任委员，北京医师协会风湿免疫专科医师分会副会长。普通高等教育国家级规划教材、卫生部规划教材5年制和8年制临床医学专业《内科学》编委。主要研究方向：风湿性疾病诊治。

2015-05-14)