HPLC测定补肾壮骨膏中补骨脂素的含量

赖杰仁

（九江市中医医院，江西 九江 332000）

HPLC测定补肾壮骨膏中补骨脂素的含量

赖杰仁

（九江市中医医院，江西 九江 332000）

目的：建立补肾壮骨膏中补骨脂素的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，Pront osi l 120-5-C18色谱柱（250 m m×4.6 m m，5 μm），流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）；流速1.0 m L/m i n；检测波长246 nm；柱温30℃；进样量10 μL。结果：补骨脂素对照品进样量在0.009 94～0.496 70 μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），补骨脂素平均加样回收率为98.20%，RSD为1.58%（n=6）。结论：本方法操作简便，准确可靠，专属性强，重现性好。适宜用于测定补肾壮骨膏中补骨脂素的含量。

补肾壮骨膏；补骨脂素；含量测定；高效液相色谱法

补肾壮骨膏系九江市中医医院自主研发的国家重点专科骨病科特色医院制剂，本品由补骨脂、杜仲、川续断、枸杞子、肉桂等十余味中药组成，具有补肾壮骨、强筋益精、固本归元的功效，临床应用于肝肾两虚、气滞血瘀的老年性关节病，骨质疏松，腰腿痛，肢体麻木，耳鸣耳聋。十余年的临床实践表明，本品安全可靠，疗效显著。基于补骨脂素在该复方制剂中作为主要的指标性成分，本文采用高效液相色谱法测定本品补骨脂素的含量，将补骨脂素的含量作为补肾壮骨膏的质量评价指标，旨在为本制剂建立内控标准。

1 仪器与药品

高效液相色谱仪：W at ers系列高效液相色谱仪（W at ers 600 cont rol l er，PD A 2996型二极管阵列检测器，Em pow er化学工作站）。SH IM A D ZU LC-2010A H T高效液相色谱仪，紫外可变波长检测器，LC-sol ut i on色谱工作站。K Q 5200B型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

补骨脂素对照品（110739-201115，99.3%，原中国药品生物制品检定所），甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

补肾壮骨膏（批号：20120401，20120402，2012 0403，20120404，20120405，20120406，20120501，2012 0502，20120503，20120504，九江市中医医院研制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Pront osi l 120-5-C18柱 （250 m m × 4.6 m m，5 μm）。流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）；流速：1.0 m L/m i n；检测波长：246 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。理论板数按补骨脂素峰计算应不得低于3 000。

2.2 检测波长的确定

用PD A检测器对补骨脂素对照品与样品溶液中与补骨脂素对照品相应位置上的色谱峰在400～ 210 nm波长范围内进行光谱扫描，结果均在246 nm波长附近处有最大吸收，故确定检测波长为246 nm。

2.3 样品溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备精密称取补骨脂素对照品10.01 m g，置 100 m L量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品母液。精密移取对照品母液10 m L，用甲醇定容至100 m L的容量瓶中，即得补骨脂素对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备装量差异项下本品适量，取约 15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇100 m L，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kH z）45 m i n，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 25 m L，蒸干，残渣加水30 m L使溶解，水溶液用乙酸乙酯提取4次，每次30 m L，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移到10 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性对照样品溶液的制备除补骨脂以外，其余各药材按补肾壮骨膏处方量制备阴性对照样品，同“2.3.2”项下供试品溶液制备方法，制得缺补骨脂的阴性对照样品溶液。

2.4 方法的专属性试验

分别精密吸取供试品溶液、阴性对照样品溶液与对照品溶液各 10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定。结果显示补骨脂素峰形良好，基线平稳，对照品、供试品在相同时间有一色谱峰，而阴性对照样品无干扰，见图1。

2.5 线性关系考察

分别吸取“2.3.1”项下补骨脂素对照品溶液1，5，10，20 μL，对照品母液5 μL，注入液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件测定补骨脂素峰面积，以进样量（X）与峰面积（Y）线性回归处理，在0.009 94～ 0.496 70 μg范围内补骨脂素进样量与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），回归方程为：

图1 补骨脂素HPLC图

Y=7.570 96×106X－6.895 73×103（n=5），见图2。

图2 补骨脂素线性图

2.6 精密度试验

精密吸取 “2.3.1”项下补骨脂素对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件，测定补骨脂素峰面积值，重复进样测定6次，计算得对照品峰面积值相对标准差为0.89%，测定方法的精密度良好。

2.7 稳定性试验

按“2.1”项下色谱条件，分别在 0，1，3，5，7，9，12，24小时，精密吸取照“2.3.2”项下制备的供试品（批号：20120401）溶液10 μL，测定供试品溶液中补骨脂素峰面积值，计算供试品补骨脂素峰面积值的相对标准差为1.27%，表明供试品溶液在24小时内基本稳定。

2.8 重复性试验

装量差异项下本品（批号：20120401）适量，研细，取约15 g，共6份，精密称定，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，处理结果数据，平均含量为19.01 μg/g，RSD为1.00%，方法重现性良好。

2.9 加样回收率试验

装量差异项下本品（批号：20120401，补骨脂素含量为19.01 μg/g）适量，研细，取6份，每份约7.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入含补骨脂素（浓度1.457 μg/m L）对照品的70%甲醇混合溶液100.00 m L，称定质量，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率（见表1）。样品中补骨脂素平均回收率为98.20%，RSD值为1.58%（n=6），补骨脂素回收率良好。

2.10 耐用性试验

装量差异项下本品（批号：20120401，20120402）适量，研细，取约15 g，精密称定，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，分别用 A：Pront osi l 120-5-C18（250 m m × 4.6 m m，5 μm），B：A gi l ent Ecl i pse X D B-C18（250 m m ×4.6 m m，5 μm），C：D i am onsi l C18（250 m m × 4.6 m m，5 μm）3种品牌的色谱柱，按“2.1”项下色谱条件测定补骨脂素含量，补骨脂素含量的RSD值低于1.00%（见表2）。

2.11 样品测定

装量差异项下本品10批次，研细，各取约15 g，精密称定，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算补骨脂素含量（见表3），补骨脂素含量在17.52～ 20.37 μg/g，10批次本品补骨脂素平均含量为18.89 μg/g。根据表3测定结果，考虑药材来源、配制操作等因素的差异影响，以平均含量的80%划作补肾壮骨膏中补骨脂素含量的限度，即规定：本品每1 g含补骨脂以补骨脂素（C11H6O3）计，不得少于15 μg。

表1 补骨脂素回收率测定结果

表2 不同色谱柱测定补骨脂素含量结果

表3 补肾壮骨膏中补骨脂素含量（n=4）

3 讨论

3.1 流动相的选择

方法学研究试验中，分别比较了以乙腈-水、甲醇-0.02 m ol/L磷酸氢二钾溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相，考察补肾壮骨膏中补骨脂素的分离情况及峰形，结果以甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）为流动相的分离情况及峰形为佳；故确定流动相为：甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）。

3.2 供试品溶液制备的方法考察

在供试品溶液的制备方法试验中，分别选择了以70%甲醇加热回流提取60分钟，超声处理（功率300 W，频率25 kH z）提取45分钟,考察提取方式对含量测定结果的影响，结果显示这两种提取方式差异不明显，而超声处理较简便易行，故选用超声处理提取方式制备供试品溶液。分别选择了85%乙醇、70%甲醇、甲醇为提取溶剂，考察提取溶剂对含量测定结果的影响，结果以70%甲醇提取效果最好。分别用乙酸乙酯分别提取3，4，5次，考察不同提取次数对含量测定结果的影响，用乙酸乙酯提取4次即可得满意结果。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：1175-1176.

[2] 张蕊，冯晓川，徐延昭，等.H PLC测定癃闭舒片中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（21）：142-144.

[3] 张广利.RP-H PLC法测定温胃舒泡腾颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].安徽医药，2010，14（11）：1288-1290.

Content Determination of Psoralen in Bushen Zhuanggu Plaster by HPLC

Lai Ji eren（Tradi t i onal Chi nese M edi ci ne H ospi t al of Ji uj i ang Ci t y，Ji angxi Ji uj i ang 332000，Chi na）

Objective:To est abl i sh a H PLC m et hod for t he cont ent det erm i nat i on of psoral en i n bushen zhuanggu pl ast er.Methods:H PLC w as carri ed out on Pront osi l 120-5-C18col um n （250 m m × 4.6 m m，5 μm）w i t h a m obi l e phase of m et hanol-0.2% phosphori c aci d （45∶55）,t he fl ow rat e w as 1.0 m L/m i n at U V det ect i on w avel engt h of 246 nm，t he col um n t em perat ure w as at 30℃，and t he sam pl e si ze w as 10 μL.Results:A good l i near rel at i onshi p of t he reference m at eri al of psoral en w as obt ai ned w i t hi n t he range of 0.009 94～ 0.496 70 μg，r=0.999 9.The average recovery of psoral en i s 98.20%，RSD=1.58% （n=6）.Conclusion:The m et hod i s conveni ent，accurat e and speci fi c w i t h a good reproduci bi l i t y,i t i s sui t abl e for t he cont ent det erm i nat i on of psoral en i n bushen zhuanggu pl ast er.

Bushen Zhuanggu Pl ast er；Psoral en；Cont ent D et erm i nat i on；H PLC

10.3969/j.i ssn.1672-5433.2015.04.005

2015-01-06）

赖杰仁，男，硕士，副主任药师。研究方向：中药新制剂与新技术。E-m ai l：sm z_l ai@163.com