哈密瓜中内生细菌的分离与鉴定

赵海霞，王 晨，孔 双，刘 娅*

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

植物内生细菌（endophyte bacteria）是指能在健康植物组织内栖居，对植物不造成实质性危害而与植物建立了和谐联合（compatible association）关系的微生物[1-2]。植物与其内生菌的这种共生现象在生物进化过程中历史悠久而普遍，大部分植物内生菌在从宿主获得稳定生活环境的同时，还可增强或赋予宿主抗病、抗干旱、固氮等能力，或通过其代谢产物促进植物生长。已有研究表明，几乎每种植物都具有丰富的内生菌存在，很多植物的内生菌是新属或者新种，但目前研究的植物种类仅几百种，因此还有巨大的内生菌资源宝库等待开发利用。新疆地处祖国西部边陲，多样化的气候和环境条件势必造成新疆植物内生菌资源的特异性和多样性，加强新疆特色植物内生菌的研究具有重要意义[3-4]。

哈密瓜（Cucumis melovar.saccharinus），是甜瓜的一个品种，出产于昼夜温差较大的新疆，以哈密所产最为著名[5]。哈密瓜对生存环境及气候条件有着其特殊的适应能力，与其对内生菌种群的选择存在着一定的相互关系。为了解哈密瓜内生菌的生物多样性，有必要对其中的内生菌进行分离鉴定，从而为进一步研究内生菌与宿主的关系及内生菌的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

哈密瓜：新疆伽师2号瓜；马铃薯：石河子市好家乡超市。

葡萄糖、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、甘油、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠：天津市富宇精细化工有限公司。以上试剂均为分析纯。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然；营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

1.2 仪器与设备

THZ-98型恒温振荡器：太仓市华美生化仪器厂；EH20A plus型电炉：北京伯泰科仪器有限公司；HPX-9272 MBE型电热恒温培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设厂；SW-CG-1C V型微生物洁净工作台：苏净集团安泰公司；BCD-265F型冰箱：海尔公司；BS2000S型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；YXQ-SG46-280S型手提式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；CX21型光学显微镜：日本Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验流程

采样→表面消毒→内生细菌分离、纯化→形态观察→分子鉴定→种属确定

1.3.2 采样

选购新疆地域特色明显的伽师2号瓜，瓜成熟度8～9成，表面健康，无病害、无机械伤。

1.3.3 样品的表面消毒与分离纯化

将采集到的上述样品用自来水冲洗干净，沥干后放入已经过紫外灯杀菌的超净台。将哈密瓜表面用酒精棉球擦拭三遍，用灭菌处理的小刀取哈密瓜的瓜皮、浅层肉、深层肉、瓜瓤、瓜籽等大小为5 cm2的组织块，用体积分数为75%乙醇浸泡3 min，无菌水冲洗，将最后一遍冲洗的无菌水涂布于PDA培养基上，作为表面消毒对照。分别将样品切成1 cm的小段，贴于PDA培养基表面培养，28℃恒温培养3～5 d，观察培养效果[6-7]。

取紧贴组织块边缘生长的菌落及时转移至新鲜的PDA培养基上，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取不同的菌落转接于新的培养基上，重复划线分离操作，直至将其纯化为单一菌落，并进行编号[8-9]。

1.3.4 菌种的保藏

将菌种进行试管斜面保藏和甘油管保藏。

1.3.5 内生细菌的菌落形态观察

观察单一菌落的表面形态，边缘形状，隆起形状和透明度[10]。

1.3.6 内生细菌的显微形态观察

使用革兰氏染色法，将细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-），并在高倍镜下观察所分离到的菌体形态[11]。

1.3.7 菌株的16S rDNA序列测定及系统发育分析

菌株经分离纯化后，送往北京市理化分析检测中心测序，反应引物为27f/1492r，反应条件为预变性95℃，5 min；变性95℃，30 s；退火48℃，30 s；延伸72℃，1 min；终延伸72℃，10 min；40个循环。依据测序结果，用Blast搜索程序从GenBank等公共数据库中调出相似性较高的相关菌株的16S rDNA基因序列进行同源性对比。

系统进化矩阵根据Kimura模型估算，用MEGA5.0软件采用邻接法（Neighbor-Joining）聚类分析，并构建出系统发育树[12-13]。

2 结果与分析

2.1 内生菌的分离、纯化

2.1.1 哈密瓜内生菌的组织块培养

将哈密瓜的皮、浅层肉，深层肉，瓜籽，瓜瓤分别在NA培养基与PDA培养基上进行组织块培养，发现各组织块周围均长出菌落，说明各组织块中均存在内生菌。

2.1.2 哈密瓜内生菌的分离纯化

组织块周围的菌经分离纯化后得到菌株21株，其中果皮中分离出5株，浅层肉和深层肉中各分离出4株，瓜瓤和瓜籽中分别分离出2株和6株。皮和籽中分离的最多，占总菌数的57.2%。实验中分离的内生菌株数量相对较少，分析其原因可能是：（1）样品本身所含内生菌较少；（2）样品消毒过于彻底，一些内生菌被杀死；（3）培养时，由于内生菌的生存环境发生了变化从而影响生长或生存；（4）存在一些不可分离的内生菌[14-15]。

2.2 内生菌鉴定

2.2.1 内生细菌的菌落形态

对纯化后的菌落进行形态观察并记录其表面形态、边缘形态、是否隆起、颜色、透明度，结果见表1。

表1 菌落形态观察结果Table 1 Results of colony morphology observation

根据表1中对菌落形态的观察，初步判断从哈密瓜中分离所得的菌株均为细菌。

2.2.2 内生细菌的革兰氏染色结果

对21株内生菌进行革兰氏染色并使用显微镜在油镜条件下（1000倍）观察，结果发现所分出内生菌都为杆菌，革兰氏颜色反应都为紫色，说明这些内生菌皆为革兰氏阳性菌。

2.2.3 菌株的16S rDNA序列测定及系统发育分析

对分离出的哈密瓜内生细菌进行DNA提取及16SrDNA基因PCR扩增，结果见图1。经过测序，从NCBI核苷酸库中进行Blast比对，选取得到同源性＞99%对比结果（当相似性＞98%可视为一个种），结果见表2，并构建系统发育树[10]，结果见图2。

图1 内生菌的PCR电泳图Fig.1 PCR electrophoretogram of endophytic bacteria

图2 邻接法构建的16S rDNA序列系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences using neighbor-joining method

表2 内生菌对比结果Table 2 Comparison results of endophytic bacteria

由表2可知，结合形态和分子鉴定，确定从哈密瓜中分离的21株内生菌皆为细菌，且均为芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌3株，甲基营养型芽孢杆菌2株，多粘类芽孢杆菌2株，蜡状芽孢杆菌1株，特基拉芽孢杆菌2株，枯草芽孢杆菌最多，为11株，占总菌数的52.4%。

由图2系统发育树可知，从哈密瓜中分离的内生菌21株均为芽孢杆菌，同属于厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目。其中P2、P3为类芽孢杆菌属，其余19株均为芽孢杆菌属，占总数的95%。从而为哈密瓜的加工、储藏等提供了有利的参考价值。并且为内生菌与宿主之间的关系及应用提供了一定借鉴。

3 结论

从哈密瓜各组织部位分离到内生菌21株，其中从皮中分离出5株，浅层肉中分离出4株，深层肉分离出4株，瓜瓤中分离出2株，籽中分离出6株。其中籽中分离的最多，占总菌数的28.6%。

经鉴定，确定哈密瓜内生菌分离出21株细菌，且均为芽孢杆菌，同属于厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目。其中淀粉芽孢杆菌3株，甲基营养型芽孢杆菌2株，多粘类芽孢杆菌2株，蜡状芽孢杆菌1株，特基拉芽孢杆菌2株，枯草芽孢杆菌最多，为11株，占总菌数的52.4%。

虽然从哈密瓜中只分离出了21株细菌，数量及种类有限，但是在一定程度上反映哈密瓜内生菌生物多样性。

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