二氧化碳浸渍法在蓝莓酒酿造中的应用

吴皓玥，董莹璨，刘雪平，战吉宬*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

蓝莓（blueberry），又称越橘，属于杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vacciniumspp.）落叶灌木型植物，果实呈扁圆形，成熟后呈深蓝色[1]，其主要分布在北半球（寒）温带地区。蓝莓主要有矮丛（V.angustifolium）、高丛（V.corymbosum）、兔眼（V.ashei）和半高丛（V.angustifolium×V.wrymbosum）四大类，其下又分为许多不同品种[2]。蓝莓中除了含糖、酸和维生素C（vitaminV，VC）外，还富含VE、VA、VB、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、熊果苷、蛋白质、花青苷、酚酸以及丰富的K、Fe、Zn、Ca等矿质元素[2-3]，MATTILA P等[4]发现蓝莓果皮每100 g含85 mg酚酸。其具有很高的医学和保健价值[5]，联合国粮农组织将其列为五大健康食品之一[6]。蓝莓酒还具有良好的风味，盖禹含等[7]采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HP-SPME）技术和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术分析以3种不同酵母发酵的蓝莓酒的主要香气，鉴定出76种香气成分。这些对人体有益的功能性成分及贡献风味的物质使蓝莓研究备受青睐，国际市场前景广阔。从产业长远发展看，应该增加蓝莓初加工以及深加工产品种类，延长产业链条，提升产品附加值。另外，蓝莓不耐贮藏，随着蓝莓种植在我国的迅速发展，蓝莓加工势在必行。如何酿造出优质的蓝莓酒便成为一个果酒酿造的热点研究方向。

二氧化碳浸渍（carbonic maceration，CM）法是将整粒浆果置于充满CO2的密闭容器中，浆果细胞内进行发酵和浸渍作用，包括酒精、挥发物质的形成，苹果酸的转化，蛋白质、果胶质的水解以及液泡物质的扩散、多酚类物质的溶解等，浸渍结束后破碎进行酒精后发酵的酿造[8-9]。由该方法酿造的果酒具有一种不同于传统发酵酒的独特风味。二氧化碳浸渍法酿造的果酒总酸，尤其是苹果酸大幅减少，且单宁含量也有所降低[8]，故果酒的口味更加柔和、清新。除在成分、风味上有以上特点外，该工艺生产周期短，企业资金周转快，能够成为企业提高经济效益的有效途径[10]。但另一方面其最佳饮用期一般不超过3个月，否则二氧化碳浸渍特征会逐渐消失，颜色衰退，色调转变为橘黄色等，因此适于喜欢新鲜型蓝莓酒的消费群体[11-12]。

CO2浸渍法在葡萄酒领域应用广泛，无论是红葡萄酒、桃红葡萄酒，还是原料酸度较高的白葡萄酒酿造均适用[9]。尤其是在法国博若莱地区以佳美葡萄酿造的博若莱新酒最为出名[13]。但是目前该酿造工艺在其他果酒中的应用甚少，因此利用CO2浸渍法酿造蓝莓酒的研究前景极为广阔。本研究利用二氧化碳浸渍法酿造蓝莓酒，对比二氧化碳浸渍法和传统酿酒法酿造出的蓝莓酒在各理化指标方面的不同，拟探究该方法对蓝莓酒品质的影响；同时利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定CO2不同浸渍时间对于酿蓝莓酒中10种有机酸酸、9种酚酸含量的影响。以期为研发二氧化碳浸渍法蓝莓酒产品提供理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝丰蓝莓：青岛佳沃蓝莓基地；亚硫酸（分析纯）：北京化工厂；酿酒酵母DV10：加拿大Lallemand公司；果胶酶（1000000U/mL）：意大利Enartis公司；白砂糖：内蒙古正北食品有限公司；干冰（食品级）：北京天竺佳禾干冰销售中心。

氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、浓盐酸、氯化钙、醋酸钠、冰醋酸、氯化铝、碳酸钠、磷酸二氢铵、磷酸、没食子酸、儿茶素均为分析纯：北京化学试剂有限公司；福林肖卡试剂（分析纯）、甲醇、乙酸均为色谱纯：北京易秀博谷试剂公司；MILI-Q水；草酸、奎尼酸、酒石酸、异柠檬酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、没食子酸、原儿茶酸、β-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、β-香豆酸、阿魏酸、芥子酸：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外分光光度计：日本岛津公司；2695XE分离单元高效液相色谱系统（配有2996PDA紫外检测器和Empower Software色谱数据处理系统）：美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓酒试验方案

表1 蓝莓酒酿造方案Table1 The fermentation plan of blueberry wines

1.3.2 分析指标

（1）基本指标测定

根据国标GB/15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，利用比重瓶法测定酒精度、滴定法测定总糖含量、酸碱滴定法测定总酸含量（以柠檬酸计）。

（2）有机酸含量的测定

参照并改进文献[14]的方法，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定蓝莓酒中草酸、奎尼酸、异柠檬酸、酒石酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸10种有机酸的含量。

样品前处理：蓝莓酒样品经高速离心（12 000 r/min、15 min、4 ℃）后，取上清液，用0.45 μm膜过滤，待反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chro matography，RP-HPLC）检测。

色谱条件：TechMate ST-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相：磷酸二氢铵 40 mmol/L，用磷酸调pH值至2.5；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；检测器：紫外检测器；检测波长：210 nm。

（3）总酚含量测定

利用福林-酚（Folin-Ciocalteus）[15-16]法测定蓝莓酒中总酚含量，酒样需经双蒸水稀释5倍前处理。以没食子酸为标准品制作标准曲线，得到标准曲线回归方程为A=0.120c+0.005，相关系数R2=0.999 0。样品中总酚含量以没食子酸表示，单位为mg/L。

（4）总花色苷含量测定

采用pH值示差法[17-18]测定蓝莓酒中总花色苷的含量，结果以花青素-3-葡萄糖苷表示，单位为mg/L。

（5）总黄酮含量测定

采用硝酸铝显色法[19]测蓝莓酒中的总黄酮含量，酒样需经双蒸水稀释5倍前处理。以儿茶素为标准品制作标准曲线，得到标准曲线回归方程为A=0.021c+0.036，相关系数R2=0.9987。样品中总黄酮含量以儿茶素表示，单位为mg/L。

采用HPLC法[20]测定蓝莓酒中没食子酸、原儿茶酸、β-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、β-香豆酸、阿魏酸、芥子酸9种酚酸的含量。

样品前处理：蓝莓酒样品经高速离心（12 000 r/min、15 min、4 ℃）后，取上清液，用0.45 μm膜过滤，待RP-HPLC检测。

色谱条件：LiChrosspher 100RP-18e色谱柱（250 mm×4 mm×5 μm）；保护柱RP-18（10 mm×4 mm）；流动相A甲醇∶乙酸∶水=10∶2∶88；流动相B甲醇∶乙酸∶水=90∶2∶8；梯度洗脱程序：0～25 min B：0～15%；25～45 min B：15%～50%；45～53 min B：50%～0；流速1 mL/min；柱温30℃；进样量15 μL；检测器：紫外检测器；紫外检测波长280 nm。

2 结果与分析

2.1 酸类物质分析

2.1.1 总酸含量

利用酸碱滴定法测定蓝莓酒总酸含量，结果见图1。

图1 传统法和二氧化碳浸渍法酿造蓝莓酒中总酸含量(x±s，n=3)Fig.1 Total acid content of blueberry wine fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3)

由图1可知，传统法酿造的蓝莓酒总酸含量高于二氧化碳浸渍法（P＜0.05）。对比不同浸渍时间，发现其对总酸含量无显著影响（P＞0.05），这可能因为二氧化碳浸渍主要对于从果皮中浸渍得到的物质含量影响较大，而有机酸大部分存在于果肉中。就总酸含量而言，二氧化碳浸渍法能够明显降低蓝莓酒的酸度，可以缓和蓝莓果实酸度较高的味感，使口感更加平衡。

2.1.2 有机酸含量

有机酸标准品高效液相色谱图见图2，样品中各有机酸含量分析结果见表2。

要加强社会整体的信用体系建设，包括个人征信体系和企业信用评价体系等，还要加快互联网金融平台与中国人民银行信用体系建设的对接。除此之外，应当加快第三方信用评级机制的建设，构建第三方动态监管体系。

图2 10种有机酸标准品HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of 10 kinds of organic acid standards

由图2可知，10种有机酸标准品色谱峰分离清晰，基线平稳，可用此方法测定蓝莓酒中有机酸含量。

由表2可知，利用高效液相色谱测定蓝莓酒中10种有机酸含量，蓝莓酒中柠檬酸含量最高，远高于其他几种有机酸。其次是琥珀酸、奎宁酸和乳酸，含量在100 mg/L左右，其他几种酸含量较少，酒石酸未检出。另外发现二氧化碳浸渍法有机酸含量整体低于传统法，除乳酸外，其他有机酸含量均为传统法较高，与总酸的规律一致。探究不同浸渍时间对于蓝莓酒有机酸含量的影响，发现除苹果酸外的大多数有机酸随浸渍时间延长含量增加。对于和大多数有机酸规律不一致的苹果酸和乳酸，浸渍时间越长的酒样苹果酸越少，乳酸含量越高，原因有待进一步探究。因此，结合总酸含量说明二氧化碳浸渍法能够降低蓝莓酒的酸度。

表2 传统法和二氧化碳浸渍法酿造蓝莓酒中10种有机酸含量(x±s，n=3)Table 2 Contents of 10 kinds of organic acids in blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3) mg/L

2.2 酚类物质分析

2.2.1 总酚含量

利用福林-酚（Folin-Ciocalteus）法测定蓝莓酒中总酚含量，结果见图3。

图3 传统法和浸渍法酿造蓝莓酒中总酚含量(x±s，n=3)Fig.3 Total phenol content of blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3)

由图3可知，对比传统法和浸渍法总酚含量，发现传统法明显高于二氧化碳浸渍法（P＜0.05）。二氧化碳浸渍10 d的酒总酚含量低于浸渍15 d的酒，但浸渍15 d和20 d的酒差异并没有显著性。可能原因为浸渍前期，CO2进入果皮细胞中使细胞破碎，且果实无氧呼吸产生的酒精能够加速果皮中的酚类物质浸出，因此前期浸渍时间越长，总酚含量越高。说明二氧化碳浸渍法能够降低蓝莓酒中酚类物质的浸出，使口感更加柔和，易于广大消费者饮用。综合酿造时间及生产成本考虑，浸渍时间以15 d为宜。

2.2.2 总黄酮含量

采用硝酸铝显色法测蓝莓酒中的总黄酮含量，结果见图4。

图4 传统法和浸渍法酿造蓝莓酒中总黄酮含量(x±s,n=3)Fig.4 Total flavonoid content of blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3)

由图4可知，浸渍10 d的酒与传统法所酿蓝莓酒总黄酮含量无显著性差异，但浸渍15d和20d的酒总黄酮含量显著高于传统法，初步说明二氧化碳浸渍加强总黄酮的浸出，并且很可能是浸渍10～15 d期间起到关键性作用。二氧化碳浸渍法不仅使蓝莓酒口感更加柔顺，同时能够加强黄酮类功能性成分的浸出，综合考虑，二氧化碳浸渍15 d最为适宜。

2.2.3 总花色苷含量

采用pH值示差法测定蓝莓酒中总花色苷的含量，结果见图5。

图5 传统法和浸渍法酿造蓝莓酒中总花色苷含量(x±s,n=3)Fig.5 Total anthocyanin content of blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3)

由图5可知，传统法花色苷含量明显高于浸渍法（P＜0.05）。探究不同浸渍时间对花色苷含量的影响发现：二氧化碳浸渍15 d的蓝莓酒总花色苷显著高于浸渍10 d和20 d的蓝莓酒，这与浸渍时间对于总酚含量影响不一致。二氧化碳浸渍法所酿蓝莓酒颜色较浅，但浸渍15 d最利于花色苷的浸出。

2.2.4 酚酸含量

酚酸标准品高效液相色谱图见图6，样品中各酚酸含量分析结果见表3。

图6 9种酚酸标准品HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of 9 kinds of phenolic acids standards

由图6可知，9种酚酸标准品色谱峰分离清晰，基线平稳，可用此方法测定蓝莓酒酚酸含量。

表3 传统法和二氧化碳浸渍法酿造蓝莓酒中9种酚酸含量(x±s,n=3)Table 3 Contents of 9 kinds of phenolic acids in blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3) mg/L

由表3可知，利用高效液相色谱测定没食子酸、原儿茶酸、β-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸9种酚酸含量，结果发现蓝丰品种蓝莓酒中的绿原酸含量远高于其他酚酸。整体而言，大多数酚酸，如没食子酸、β-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等在传统法蓝莓酒中的含量明显少于二氧化碳浸渍法，且浸渍时间越长，酚酸含量越高。就酚酸而言，初步说明二氧化碳浸渍法相较于传统法有利于酚酸类物质的浸出，且浸渍20 d或更长效果更优。

3 结论

本试验以蓝丰蓝莓为研究对象，分别用二氧化碳浸渍法浸渍处理10 d、15 d、20 d后酿造出蓝莓酒，重点研究有机酸和酚类物质。根据试验结果来看，可初步得出以下结论：二氧化碳浸渍法和传统法酿造的蓝莓酒在酸类物质与酚类物质含量上有显著差异（P＜0.05）。蓝丰品种蓝莓酒中最主要的有机酸为柠檬酸。二氧化碳浸渍法可以降低蓝莓酒的酸度；在酚酸类物质方面，含量最高的酚酸为绿原酸。CO2浸渍法所酿蓝莓酒酚酸含量高于传统法，且浸渍天数越多的酒样酚酸含量越高（P＜0.05），初步说明二氧化碳浸渍法可以加强酚酸物质的浸出。总黄酮与总花色苷含量均为浸渍法高于传统法（P＜0.05），但传统法的总酚含量高于浸渍法。

综合而言，二氧化碳浸渍法能够使酒体酸度降低，酚类、色素浸出减少，使口感更加协调柔顺，易受到广大消费者的青睐。综合考虑生产时间与成本，CO2浸渍15 d为宜。

[1]薄艳秋.蓝莓花青素的提取和抗氧化研究[D].哈尔滨：东北农业大学硕士论文，2012.

[2]赵秀玲.蓝莓的成分与保健功能的研究进展[J].中国野生植物资，2011（6）：19-23.

[3]郑建仙.功能性食品[M].北京：中国轻工出版社，1997.

[4]MATTILA P,HELLSTION J,TORRONEN R.Phenolic acids in berries,fruits,and beverages[J].J Agr Food Chem,2006,54(19):7193-7199.

[5]李亚东.我国越桔产业发展的思考[J].中国果树，2006（1）：46-47.

[6]李亚东，惠 铁，张志东，等.中国蓝莓产业化发展的前景[J].沈阳农业大学学报，2001，3（1）：39-42.

[7]盖禹含，辛秀兰，杨国伟，等.不同酵母发酵的蓝莓酒香气成分GC-MS分析[J].食品科学，2010，31（4）：171-174.

[8]刘 晶，王 华，李 华，等.CO2浸渍发酵法研究进展[J].食品工业科技，2012，33（3）：369-372.

[9]王西锐.葡萄酒CO2浸渍发酵的研究[D].杨凌：西北农林科技大学硕士论文，2002.

[10]CHINNICI F,SONNI F,NATALI N,et al.Colour features and pigment composition of Italian carbonic macerated red wines[J].Food Chem,2009,113(2):651-657.

[11]郭 呈，袁小悦，李斯屿，等.冷浸渍对赤霞珠干红葡萄酒中黄酮醇物质含量的影响[J].中国酿造，2014，33（12）：29-33.

[12]SACCHI K L,BISSON L F,ADAMS D O.A review of the effect of winemaking techniques on phenolic extraction in red wines[J].Am Soc Enol Viticult,2005,56(3):197-206.

[13]SUN B S,SPRANGER M.Changes in phenolic composition of Tinta Mifflda red wines after 2 years of ageing in bottle:effect of winemaking technologies[J].Eur Food Res Technol,2005,221(3-4):305-312.

[14]胡小露，刘 卉，鲁 宁，等.HPLC法同时测定蓝莓汁及其发酵酒中9 种有机酸[J].食品科学，2012，33（16）：229-232.

[15]李 静，聂继云，王孝娣，等.Folin-Ciocalteus法测定葡萄和葡萄酒中的总多酚[J].中国南方果树，2007，36（6）：86-87.

[16]梁 晨，张倩雯，盛启明，等.不同品种蓝莓酒抗氧化能力及其多酚含量分析[J].中国酿造，2013，32（8）：46-49.

[17]MÓNICA GIUSTI M,WROLSTAD RONALD E.Characterization of red radish anthocyanins[J].J Food Sci,1996,61(2):322-326.

[18]孙婧超，刘玉田，赵玉平，等.pH示差法测定蓝莓酒中花色苷条件的优化[J].中国酿造，2011，30（11）：171-174.

[19]WOLFE K,WU X Z,LIU R H.Antioxidant activity of apple peels[J].J Agr Food Chem,2003,51(3):609-614.

[20]翁芳华，陈建业，温鹏飞，等.蓝莓酒中11种酚酸的高效液相色谱测定[J].食品科学，2006，27（9）：223-226.