线粒体蛋白酶对线粒体动力学的调控及机理

王称心　宋质银

摘 要：线粒体是细胞的主要供能细胞器，也参与磷脂合成、氨基酸代谢等生物化学反应，同时参与钙离子的贮存和调节，并在细胞免疫、增殖、分化、凋亡、自噬等多种生理活动中起着重要的调节作用。线粒体相互联系，构成线粒体网络，该网络维持着分裂、融合的动态平衡。线粒体动力学即研究线粒体的分裂、融合、运动等方面，并且参与线粒体的质量控制，动力学的紊乱与代谢性疾病、神经疾病等密切相关。OPA1是调节线粒体内膜融合的重要蛋白，L-OPA1与S-OPA1对介导内膜的融合非常重要。线粒体内的蛋白酶体系通过多种机制来调节其动力学，其中很重要的机制就是剪切或降解OPA1。阐明线粒体蛋白酶的作用机理对于探明许多疾病的发病机制有着重要的意义。

关键词：线粒体动力学；线粒体质量控制；蛋白酶；OPA1；疾病

中图分类号 Q25 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）10-25-05

Abstract：Mitochondria provides main source of energy for cell and also is involved in some biochemical reactions such as phospholipid synthesis and amino acid metabolism.Mitochondria regulates the level of Ca2+，which is an important signal for some physiological activities such as immunity，cell proliferation，cell differentiation，apoptosis and autophagy.Mitochondria connects with each other，forming a mitochondrial network which maintains the dynamic balance of fusion and fission.Mitochondrial dynamic is about the fusion，fission and transposition of the organelle and is invoved in mitochondrial quality control.The disorder of dynamics is related to metabolic diseases and neurological diseases.Optic atrophy 1（OPA1），which composed of L-OPA1 and S-OPA1，is of importance to regulate the fusion of mitochondrial inner membranes.The proteases in the mitochondria regulate its dynamics through a variety of mechanisms One important mechanism is to clave or degrade OPA1.Elucidating the role of mitochondrial proteases is of great significance to reveal the pathogenesis of many diseases.

Key words：Mitochondrial dynamics；Mitochondrial quality control；Proteases；OPA1；Diseases

线粒体是细胞的主要供能细胞器，有“能量工厂”之称，同时还参与钙离子的调节、细胞增殖、细胞分化、细胞死亡等活动。因此，线粒体的质量调控非常重要。线粒体通过分裂、融合的动态平衡构成线粒体网络，即为线粒体动力学，线粒体动力学是线粒体质量调控的重要方式。本文就线粒体内的蛋白酶通过调节线粒体动力学来调节线粒体质量综述如下。

1 线粒体的超微结构及其功能

线粒体是普遍存在于真核生物中的细胞器，它由2层膜包裹，在光学显微镜下可以看到颗粒状或短线状，因此得名[1]。通常情况下，直径为0.3～1.0μm，长度为1.5～3.0μm。但是，其大小和形态具有组织特异性，也会随着细胞周期、细胞分化、细胞死亡等活动而呈现变化[2]。在细胞内，有数百至数千个线粒体，它们形成相互联系、高度动态的网络，该网络受到高度调控[3]。由于线粒体是细胞ATP的重要来源，被称为“能量工厂”[1]，同时也是还原力（NADH和NADPH）的主要来源[4]。

线粒体由内膜和外膜2层单位膜封闭包裹。外膜平展，起到与外界的屏障作用，但通透性高，主要参与膜磷脂合成、色氨酸降解、脂肪酸链延长等活动。内膜富含心磷脂，通透性差，这也是质子电化学梯度建立和ATP的合成所必需[5]。内膜向内折叠延伸，特化成嵴。ATP合酶附着在嵴上，嵴是氧化磷酸化的关键场所[6]。内外膜之间的空间为膜间隙，其宽度比较稳定，维持在6～8nm，并且受到精密的调控。内膜所封闭的空间被称为基质，基质中存在三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等相关的酶，以及DNA、RNA、核糖体及转录、翻译所必需的重要分子[1]。大量的研究证实，线粒体除了为细胞提供能量，也是活性氧自由基ROS的主要来源，而ROS可以引起细胞损伤，引起程序性细胞死亡[7]。

线粒体对细胞的命运有着决定性的作用，它参与了细胞周期进程的调控、细胞分化、发育、免疫应答、脂类与钙离子稳态的调节、凋亡、自噬等活动[8]。线粒体的这些功能与其结构变化有很大的关系[9]，线粒体的结构异常会导致很多疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病等[2]。

2 线粒体动力学

2.1 线粒体动力学及其调控 线粒体的网络是高度动态的，其结构由融合、分裂、运动、聚集等进程来决定。而这些进程受到了严格的调控，它们相互协作，并应答于各种细胞信号通路及压力应激反应。线粒体分裂和融合这2个相反的活动进程，是维持线粒体的形成和功能所必需。线粒体的融合协助各组分间信息传递、物质流通，并且可以缓解暂时的功能受损。线粒体的分裂协助了线粒体运动、分布、质量控制介导的细胞器降解（[10]。

线粒体中高度保守的蛋白，动力相关蛋白DRP（dynamin related protein）家族中的成员调节着线粒体的分裂、融合这2个相反的进程。这些蛋白的分子量都相对较大，是自我折叠、组装的GTP酶[11]。线粒体外膜蛋白Mfn1、Mfn2，内膜蛋白OPA1调节着线粒体的融合[3]。线粒体分裂蛋白Drp1，介导了线粒体的分离。这4个DRPs构成了线粒体分裂融合机制的核心，并受到许多调控机制如蛋白稳定表达、翻译后修饰、蛋白酶水解等活动的严密调节。

在膜式生物酿酒酵母中，首次发现了DRPs的效应蛋白Mdv1，随后又在许多后生生物中发现了Mff、MiD49、MiD51等效应蛋白。这些蛋白招募可溶性的Drp1至线粒体外膜。基于对Mdv1的研究，推测这些蛋白可能刺激了DRPs组装整合成螺旋状结构，并包裹在线粒体周围。Drp1的GTP酶活性结构域位于2个相近的螺旋环之间，当GTP水解时，引起一系列构象变化，进而引起螺旋环收缩，从而导致了线粒体的分裂。在分裂进程中，Drp1所介导的线粒体膜的重塑过程，在多个位点受到调控，包括将Drp1招募到线粒体外膜上、GTP水解、Drp1螺旋环的收缩、解聚、Drp1翻译后修饰等。Drp1翻译后修饰包括磷酸化、苏素化、泛素化、亚硝基化、糖基化[12]。经过选择性剪切，形成了不同Drp1异形体，它们会有不同的翻译后修饰。也有研究表明，有一些内质网围绕在线粒体周围，它们相互结合的位点是线粒体分裂所必需的。这个过程可能涉及到ER相关蛋白INF2，myosin II所介导的actin的多聚化。

对于线粒体融合的机理，目前知之甚少。据相关报道，DRPs参与了线粒体的融合，据推测，GTP水解依赖性的构象改变和组装对于线粒体融合过程中膜质的重塑、脂类的融合起着重要的作用。有实验表明，线粒体内膜和外膜的融合经历了2个不同的阶段，膜聚集和脂类相融，它们都需要融合型的DRPs的参与。膜质聚集需要融合型DRPs自组装，随即引起GTP水解，构象改变，脂双层的不稳定，进而促进了脂质的混合，线粒体的融合[13]。OPA1介导了线粒体内膜的融合，在内膜融合时，OPA1起到了类似于分子马达的驱动作用，并需要prohibitins等蛋白的协助。线粒体去乙酰化酶Sirt3调节OPA1的乙酰化程度，乙酰化的OPA1活性降低[14]。在一些压力状态下，乙酰化也可以调节线粒体外膜的融合，Mfn1的乙酰化，可以促进其泛素化，进而被降解。在一些特异的刺激下，Mfn1/2会被磷酸化或泛素化，进而引发了降解，从而抑制了线粒体外膜的融合。此外，Mfn2既定位在线粒体，又定位在内质网，这预示蛋白的不同定位可能是调节线粒体融合的一种方式[15]。线粒体定位的Mfn1/2与内质网定位的Mfn2相互作用，使线粒体聚集在内质网附近。因此，线粒体与内质网的结合位点可能直接调控了线粒体的融合。线粒体内膜与外膜融合的机制比较复杂，还有更多的调控机制有待阐明[16]。

2.2 线粒体质量控制与线粒体动力学 线粒体的质量控制对于细胞避免死亡至关重要，线粒体通过多种机制来维持其稳态。首先，线粒体有特有的蛋白酶体系来降解错误折叠的蛋白[17]。其次，受损的线粒体外膜的蛋白会被细胞质中的蛋白酶清除[18]。再次，通过不停的分裂融合进程，线粒体网络修复其中的受损成分，通过分裂，使受损的线粒体得以被分离，通过融合，使正常的线粒体之间的物质得以交流[19]。另外，在氧化应激条件下，一部分线粒体通过出芽形成线粒体囊泡，这些囊泡随后与溶酶体融合，降解线粒体中氧化损伤的蛋白。另一方面，损伤的线粒体可以形成球状体，然后被溶酶体标记，这也许是移除受损线粒体的一种方式。最后，受损线粒体可以被自噬小体包裹来引发溶酶体依赖的线粒体自噬[19]。

有研究表明，功能受损的线粒体可以通过使融合机制失去活性或加速分裂来失去融合的能力，来抑制受损的线粒体与健康线粒体所形成的网络混合。用荧光标记线粒体可以观察到，线粒体经历着不停的分裂融合循环，而且表现出很强的异质性[20]。通过分裂产生的子代线粒体，有的膜电势升高，有的膜电势降低。膜电势高的线粒体被认为是质量与功能完好的线粒体，将会进行融合。膜电势低的线粒体通常认为是功能受损的线粒体，将会通过线粒体自噬途径被降解。因此，线粒体的融合与分裂的动态循环，可能通过融合来保护完好的线粒体，通过分裂来清除受损的线粒体[2]。当线粒体功能受损并不严重时，将会引发蛋白酶的加工和OPA1的失活，进而导致线粒体内膜的融合障碍，而不影响外膜的融合。严重的损伤将会激活Pink-Parkin介导的Mfn1和Mfn2的泛素化和蛋白酶体的降解，进而诱发线粒体自噬[21]。然而，在营养供应充分的条件下，Mfn1和Mfn2 knock out的MEF细胞系并没有增加线粒体自噬，这预示仅有线粒体分裂并不足以引发线粒体自噬[19]。可能的机制是除了线粒体片段化，线粒体还需要功能受损或去极化来招募自噬受体蛋白，引发自噬。也有可能是体积较小的线粒体更容易被自噬体包裹，进而形成更长的线粒体。研究证明，在CCCP处理后，线粒体蛋白酶OMA1的活性升高，促进了L-OPA1的剪切，抑制了线粒体的融合，导致线粒体的片段化[14]。

3 线粒体蛋白酶对线粒体动力学的调节

3.1 线粒体中蛋白酶体系间的相互作用 线粒体稳态的维持依赖于定位在线粒体不同部位的蛋白酶。泛素-蛋白酶体系通过外膜相关的降解（OMMAD）机制，在外膜的胞质侧对蛋白进行质量控制。OMMAD由膜锚定的RING-finger型E3泛素连接酶和AAA-ATP酶Cdc48/p97结合被泛素化的蛋白，将它们运输到细胞质，进行降解[22]。有实验表明，线粒体其他区域的蛋白可以再度定位到线粒体外膜，然后被泛素化，进而被降解[28]。

在膜间隙有可溶型的蛋白酶HtrA2/Omi和金属蛋白酶Atp23。HtrA2/Omi是丝氨酸蛋白酶，参与调节线粒体泛素连接酶MulanE3，HtrA2/Omi的下调，会引起Mulan E3的积累，引起线粒体自噬（21）。在酵母中，Atp23具有双重功能，既参与蛋白质的加工组装，又参与辅助ATP合成酶的生物合成。

2个定位于内膜的蛋白酶复合物是线粒体质量调控的重要执行者，即i-AAA和m-AAA蛋白酶。i-AAA蛋白酶的催化结构域面向膜间隙，而m-AAA的活性中心在线粒体基质侧。金属蛋白酶OMA1和presenilin相关的菱形蛋白酶PARL（也被称为Pcp1，Rbd1或Mdm37）也定位在线粒体内膜[23]。OMA1在ATP的作用下，调节了错误折叠的多功能的内膜蛋白Oxa1的剪切。在果蝇和哺乳动物中，PARL剪切PINK1和HtrA2/Omi。PARL在A130位剪切Pink1，并且PARL对PINK1的剪切是其适当定位所必需。一旦进入线粒体，PINK1的线粒体定位序列将会被MPP切除，形成60kd的肽段。经PARL在A130剪切后，形成52kd的肽段，并以一种未知的机制并释放到细胞质基质中。更重要的是，依赖于PARL的剪切，PINK1招募下游的功能蛋白Parkin到受损的线粒体，来起始线粒体自噬，而线粒体自噬是一种重要的线粒体质量调控机制[24]。线粒体自噬被抑制可能会导致病理性的帕金森综合征，在该病症的病人的体内也发现了N端突变的PARL[25]，因此，PARL可能在预防帕金森综合症起着重要的作用。

3.2 线粒体蛋白酶通过剪切OPA1对线粒体动力学的调控 哺乳动物的OPA1在许多细胞活动中起着作用，如线粒体嵴的构筑、凋亡抑制、mtDNA完整性的维持、氧化磷酸化的维持等，这些活动又与线粒体动力学相互影响。OPA1的生物合成，受到转录和翻译2个水平的调控。在酵母中，OPA1同源蛋白Mgm1有2条剪接体，在哺乳动物中OPA1有许多的剪接体。OPA1 pre-mRNA在外显子4，4b和5b处选择性剪接，产生了组织特异性表达的8种mRNA通过选择性剪接，产生了至少8条mRNA来编码OPA1。剪接体特异性的干扰技术表明，这些不同形式的OPA1剪接体有不同的功能[14]。这些mRNA编码的多肽，除了含有线粒体基质蛋白酶MPP剪切位点外（切除线粒体引导序列），都还有S1剪切位点，有些多肽的C端还有S2剪切位点。S1、S2位点的剪切发生在外显子5或5b所编码的肽段序列，使得OPA1失去跨膜结构域。从理论上推测，任何一条mRNA经翻译后，都可以产生一条长形式的OPA1，即L-OPA1（只在MPP位点剪切）和一条或更多条短形式的OPA1，即S-OPA1（在S1或S2位点剪切）。长形式的OPA1与短形式的OPA1对于线粒体的融合都很重要，它们形成寡聚体，来维持嵴的构筑。促凋亡等应激刺激，扰乱了它们的寡聚化，使L-OPA1转变为S-OPA1，抑制了线粒体的融合[26]。持续的分裂使线粒体网络出现片段化，受损的线粒体经线粒体自噬或凋亡等途径被选择性消除。OPA1的水解因此对于线粒体的质量控制很重要。

但对于OPA1在S1及S2位点的剪切机制，目前了解很少。有实验数据表明，菱形蛋白酶PARL及m-AAA蛋白酶paraplegin参与了OPA1的剪切。但是细胞在缺乏PARL及paraplegin的情况下，OPA1的剪切并未受到明显的影响，在PARL敲除的细胞系中，OPA1的加工并没有出现异常。在paraplegin的RNA干扰细胞系中，OPA1的加工也只是受到了一定的影响，而没有完全丧失，这说明OPA1的剪切机制还有其他蛋白的参与[27]。另外，在酵母中表达OPA1时，它的剪切依赖于2个其他的m-AAA蛋白酶Afg3L1和Afg3L2。最近有报道称，线粒体内膜蛋白酶OMA1及i-AAA蛋白酶YME1L分别在S1，S2位点剪切OPA1。L-OPA1可以被不同的诱导性蛋白酶剪切。L-OPA1定位在线粒体线粒体内膜，S-OPA1定位在线粒体膜间隙。在应激条件下，如线粒体膜电势降低、ATP缺陷、凋亡等均可诱导L-OPA1的剪切。这种剪切是快速并彻底的，使OPA1完全失活。质子载体CCCP使线粒体膜电势降低，使OPA1失活，使线粒体融合受阻。当CCCP被洗脱后，线粒体膜电势得以恢复，其形态会重新构筑成细纤维状，但这需要OPA1的重新合成[28]。

人类的Yme1L蛋白酶定位于线粒体内膜，水解酶活性依赖于ATP，属于高度保守的AAA蛋白酶家族，它有AAA结构域以及M41金属蛋白酶结构域。M41金属蛋白酶结构域都拥有HEXXH序列，是金属结合位点。YME1L的缺失，使OPA1在S2位点的本底水平的剪切受损，使线粒体出现片段化，扰乱了嵴形态构筑，使细胞更易于凋亡[29]。OMA1是一种不依赖于ATP的锌离子金属蛋白酶，有多次跨膜结构域和锌指结合基序。在OMA1缺失的条件下，OPA1在S1位点的剪切出现障碍，但线粒体的形态没有受到很大的影响，但在压力刺激下，线粒体出现片段化，需要OMA1剪切OPA1。OMA1缺陷鼠可以存活，但会患饮食导致的肥胖症，并且机体的生热作用异常，这预示着在维持代谢平衡时，OMA1对OPA1的剪切起着重要作用[14]。

4 展望与结语

综上所述，线粒体动力学受到严密的调控，并且参与了线粒体质量调控。线粒体动力学的紊乱与代谢性疾病如糖尿病、动脉粥样硬化，以及神经疾病如帕金森综合症、早老性痴呆症等都密切相关。线粒体蛋白酶OMA1、Yme1L、PARL通过剪切或降解OPA1调节线粒体动力学，但是具体机理尚未阐明。因此，研究蛋白酶的作用机理将有助于探明一些疾病的发病机理，从而可能找到一些重要的分子靶标。

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