拟南芥DNA甲基化及去甲基化研究进展

卓婉清　腊红桂

摘 要 DNA甲基化及去甲基化是表观遗传的重要标志，广泛存在于细菌、动物、植物中，在控制转座子转录沉默、调控基因表达（X染色体失活，基因印迹，副突变）、维持植物发育等方面发挥重要作用。DNA表观修饰不改变基因序列，仅改变碱基修饰，并通过有丝分裂或者无丝分裂在后代中遗传。DNA甲基化是在甲基转移酶作用下，以S腺苷甲硫氨酸为甲基供体，使DNA胞嘧啶发生甲基化。研究发现，DNA去甲基化普遍存在于生物体内，在植物中，DNA糖基化酶介导的碱基切除修复机制被发现。基于此，对模式植物拟南芥中存在的DNA甲基化及去甲基化机制进行综述。

关键词 DNA甲基化；DNA去甲基化；表观遗传学

中图分类号：Q943 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）09-129-05

表观遗传学（Epigenetics）的词根最早出现于2000多a前，亚里士多德提出后生理论（The Theory of Epigenesis）。直到1975年，Holiday.R对表观遗传学进行了较为准确的解释，他认为，表观遗传学不仅在发育过程，而且应该在成体阶段研究可遗传的基因表达改变[1]。经典遗传学认为，核酸是遗传的分子基础，生命的遗传信息都是由核酸序列决定的。然而随着现代分子遗传学的发展，人们发现，不仅DNA序列包含遗传信息，核苷酸、组蛋白、染色质水平的修饰也会造成基因表达模式的改变，并可以在后代中稳定表达。

DNA甲基化是最常见的表观遗传现象，常见的DNA甲基化发生在DNA链上的胞嘧啶第五位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶被修饰为5甲基胞嘧啶（5mC）。与之相反，DNA去甲基化则是指5甲基胞嘧啶（5mC）被胞嘧啶取代的过程。

1 拟南芥DNA甲基化模式

在拟南芥中，DNA甲基化包括从头开始甲基化及维持性甲基化。从头开始甲基化是指DNA两条链都没有甲基化，通过甲基转移酶（DNMTs）先使其中一条链甲基化，然后再使另一条链甲基化。维持性甲基化指DNA中已有一条链发生了甲基化，在DNA复制过程中通过甲基转移酶来维持甲基化状态[2]。DNA甲基化主要发生在对称的CG，CHG序列和不对称CHH序列（H代表A，G，C，T）。其中CG甲基化的维持由DNA甲基转移酶MET1（ DNMT1-like enzyme ）调控，CHG由CMT3植物特异甲基转移酶来维持[3，4]，通过与KYP（H3K9me2甲基化转移酶）形成回路，维持CHG甲基化[5]。不对称的CHH甲基化在复制过程中不能保持，由RdDM（RNA介导的DNA甲基化）通道的甲基转移酶DRM1和DRM2 发挥作用而形成[6]。新的研究发现，在met1和cmt3缺失突变体中，CHH基因组水平甲基化有更大的影响，相较于drm1和drm2突变体，这说明CMT3和MET1对于CHH甲基化可能有一定作用。此外维持CG，CHG甲基化可能也需要DRM1和DRM2作用[7]。拟南芥甲基化位点中，1/3位点与siRNAs 相关[8]，剩下2/3位点独立于siRNAs。甲基转移酶可以靶向依赖siRNA（siRNA-dependent）通道和不依赖siRNA （siRNA-independent）通道实现CG或者非CG甲基化。

1.1 MET1介导的CG甲基化

MET1具有与哺乳动物DNMTs相同的结构域，在DNA复制过程中，发挥DNA甲基转移酶作用维持植物CG甲基化。此外，met1突变体表现出明显的花期延迟现象[9]，且通过全基因组甲基化分析发现其对于非CG甲基化水平也有一定影响。

1.2 CMT3介导的CHG甲基化

CMT家族含有染色质结合结构域编码植物特异甲基转移酶，具有3个成员——CMT1、CMT2和CMT3，主要参与维持CHG甲基化。拟南芥中，通过对CMT3及KYP组蛋白甲基转移酶进行结构分析，揭示CMT3与KYP形成协同反馈回路共同维持CHG甲基化及TE转座子沉寂[10]。KYP被招募到CHG甲基化位点通过SET和SRA结构域；同时，CMT3的BAH结构域识别H3K9me2甲基化位点，招募CMT3形成CHG甲基化[11，12]。

1.3 RdDM介导的CHH甲基化

在拟南芥中，24个核苷酸大小的小干扰RNA （24-nt siRNAs）和长链非编码RNA指导的重新开始DNA甲基化及转录沉寂过程即为RNA指导的DNA甲基化（RdDM）。RNA介导的转录基因沉寂是一个保守的现象，在真菌、植物、动物中都会发生。对于许多细胞内功能如转座子沉寂，基因组稳定性，细胞保持等功能维持具有一定作用[13，14]。RdDM模型目前认为：RNA聚合酶Pol IV 产生单链RNAs 作为siRNAs前体，Pol IV与RNA依赖的RNA聚合酶II（RDR2）紧密联系，RDR2对Pol IV的转录产物加工成双链RNA，这个过程借助ATP依赖的染色质重塑因子CLSY1 作用。dsRNAs 被DCL3酶切成 24-nt siRNAs小片段，通过HEN1作用使siRNAs甲基化。单链siRNAs与AGO4或者AGO6[15]形成RdDM 效应因子复合物。AGO4复合物结合于RNA聚合酶Pol V ；同时，Pol V转录需要蛋白复合物DDR（包括DRD1、DMS3、RDM1）。其中，DRD1 是ATP依赖的染色质调控因子，DMS3 是黏连蛋白类似物， RDM1 具有单链DNA结合活性。RDM1是RdDM 效应因子复合物的一部分，既与AGO4 相联系又与重新开始的甲基转移酶DRM2 一起催化CG， CHG和CHH甲基化的形成。Pol V转录物的进一步扩增需要一些RNA结合蛋白，其中SPT5L/KTF1被招募到Pol V 转录独立于AGO4因子，起着稳定效应因子复合物作用[16]。IDN蛋白复合物也结合于 Pol V 转录物招募 SWI/SNF染色质重塑复合物，一起参与异染色质形成。而最近又发现，DTF1识别组蛋白H3K9甲基化，与CLSY1 相互作用在RdDM途径上游发挥作用[17]。

2 拟南芥DNA去甲基化模式

DNA去甲基化包括被动去甲基化和主动去甲基化。被动去甲化发生在DNA复制过程中，DNA甲基转移酶不活跃，导致未被甲基化的位点保留在新合成的链中。而活跃的去甲基化独立于DNA复制，存在5种可能的机制DNA糖基化酶初始的碱基切除修复机制、脱氨基作用及G/T碱基错配修复机制、核酸切除修复机制、氧化去甲基化机制及水解去甲基化[18]。在拟南芥中研究进展主要集中于DNA糖基化酶初始的碱基切除修复及氧化去甲基化两个机制上。其中，DNA糖基化酶家族中最先发现ROS1基因，之后DML2 和DML3等与ROS1功能类似的基因被发现，也发挥着去甲基化作用。目前认为 ROS1双官能团酶切除甲基，切割碳链暴露缺口，产生脱碱基位点，ZDP和APE1L将3'磷酸变成3'羟基，最后通过DNA聚合酶和DNA连接酶进行缺口修复，使甲基化位点脱甲基化[18-20]。ROS1是该通道中发挥作用的主要功能蛋白[19]，那么ROS1是怎么靶向特异的位点？最近研究表明，甲基结合蛋白MBD7特异结合于高度甲基化的CG位点，并通过与IDM2和IDM3的相互作用，招募组蛋白乙酰转移酶IDM1催化H3K18和H3K23的乙酰化[21，22]，进而招募去甲基化酶ROS1和其他去甲基化酶来限制DNA甲基化的延伸，防止基因沉默。氧化去甲基化机制揭示JmjC 蛋白对组蛋白H3K9和H3K36甲基化进行氧化去甲基化。在拟南芥中，JmjC 组蛋白去甲基化酶相关蛋白家族的成员 IBM1被发现，使组蛋白H3K9去甲基化，阻止DNA中BNS（BONSAI ——位点高度甲基化[23，24] ，研究还发现负责可变剪切的EDM2等蛋白[25]通过调节H3K9去甲基化酶IBM1的表达参与DNA去甲基化。

3 拟南芥DNA去甲基化相关的酶

3.1 ROS1（Repressor Of Silencing 1）

ROS1基因编码DNA去甲基化酶，是一个双官能团蛋白，既糖基化DNA又发挥裂解酶作用裂解DNA，对于维持转基因及同源内源基因的表达非常重要。ROS1通过抑制启动子甲基化来抑制RD29A-LUC转基因沉寂及内源基因沉寂[19]。在ROS1活性缺失的情况下，RdDM介导特异位点高度甲基化并使转录沉寂。

3.2 IDM1（Increased DNA Methylation 1）

IDM1，拟南芥DNA去甲基化的调控因子，对于防止ROS1调控的同源多拷贝基因及重复序列基因的高度甲基化非常重要。通过亚硫酸盐测序发现在idm1突变体中造成拟南芥基因组DNA甲基化升高的位点与ros1突变体产生的甲基化位点有较高的重合度，推测IDM1参与ROS1介导的去甲基化调控通路。 IDM1 结合于染色质中缺乏组蛋白H3K4二甲基及三甲基位点，使组蛋白H3乙酰化创造一个染色质环境为后续ROS1发挥作用。IDM1 是一个组蛋白H3乙酰基转移酶，具有三个结构域。通过DNA甲基化识别MBD结构域识别CG甲基化位点，植物同源PHD结构域识别未被甲基化的组蛋白H3K4表观遗传特征，组蛋白乙酰基转移酶HAT结构域使组蛋白H3K18和H3K23乙酰化[26]。由于IDM1与ROS1不能共定位，推测一个未知的与ROS1相互作用的蛋白可能识别乙酰化的H3K18 和H3K23 标志，招募ROS1靶向特异位点进行DNA去甲基化作用。

3.3 IDM2及IDM3（Increased DNA methylation 2 and Increased DNA methylation 3）

IDM2 属于高度保守的ACD蛋白家族，ACD蛋白最早在动物中发现，在各种细胞内进程及抵抗逆境病害等方面有着重要作用[27，28，29]，在植物当中大部分ACD蛋白属于热休克蛋白[30] （sHSPs）.大量研究表明ACD蛋白作为分子伴侣发挥作用[27] ，IDM2是一个编码α-晶体结构域的核定位点白其转录水平并不受热激影响，与IDM1具有相互作用证明它可能作为分子伴侣与IDM1一起参与组蛋白H3K18 乙酰化，在DNA活跃去甲基化及阻止转录沉寂中发挥作用[31]。IDM3与IDM2类似，具有α-晶体结构域且与MBD7具有相互作用[21]。

3.4 MBD7（Methyl-CpG-Binding Domain）

之前研究表明，DNA活跃去甲基化主要是由ROS1蛋白发挥主要作用，但是ROS1蛋白怎么靶向特异的甲基化位点并不清楚，而研究发现MBD7在特异识别甲基化位点发挥作用。MBD7蛋白的N端为甲基化识别结构域特异性识别CG甲基化位点，C端有很强的染色质识别能力。与IDM2及IDM3具有相互作用，进一步招募IDM1[26] 及其他一些蛋白进行组蛋白H3K18 和H3K23乙酰化，为ROS1发挥作用创造染色质环境（图1）。mbd7 突变体导致NPTII转基因沉寂 但不影响ProRD29A：LUC转基因沉寂，全基因组甲基化位点分析mbd7突变体甲基化位点与ros1突变体造成的甲基化位点有部分重合，推测MBD7可能是ROS1调控通道中的蛋白[22]，且MBD7靶向靠近染色体中心高密度DNA甲基化位点， 同时影响Gypsy类型反转座子活动。

3.5 ZDP（Zinc Finger DNA 3Phosphoesterase）

ZDP突变体导致DNA高度甲基化及报告基因转录沉寂，全基因组甲基化分析zdp突变体使上百个内源基因位点高度甲基化，并且发现DNA磷酸化酶ZDP与ROS1具有相互作用，是ROS1活跃去甲基化分支的下游蛋白[32]。ROS1作用位点后产生单核苷酸缺口，ZDP将 3'磷酸变为3'羟基，通过单链核苷酸切除和长链DNA合成[33，34] ，使后续发生DNA聚合及连接反应修复缺口，实现去甲基化过程。最近又发现ROS1作用后的位点并不继续β，δ裂解而仍然是β裂解产物，产生3'不饱和醛基，不依赖于ZDP活动，可能通过AP 核酸内切酶 （APEs）发挥作用。

3.6 APE1L（Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease）

APE1L，拟南芥AP核酸内切酶的一种，与ROS1蛋白在体内共定位。ROS1蛋白β裂解产生3'不饱和醛基，随后APE1L将不饱和醛基转换成3'羟基。生化数据表明APE1L有微弱的3'磷酸活性，证明APE1L属于ROS1调控通道另一分支的DNA活跃去甲基化下游蛋白，独立于ZDP分支通道（图2）。通过对突变体ape1l全基因组高度甲基化检测[20]。推测APE1L是一个多功能酶，可能与ZDP一起作用于DME糖基化酶调控通道，控制胚乳中印记基因及种子的生长。

3.7 IBM1（Increase in BONSAI Methylation 1）

IBM1是组蛋白H3K9me2去甲基化酶，在拟南芥中一方面，甲基转移酶CMT3与组蛋白甲基化酶KYP产生CHG甲基化及组蛋白H3K9me2；另一方面，由存在的CG甲基化招募IBM1发挥去除KYP产生的H3K9me2作用（图3）。IBM1调控的甲基化位点位于IBM1基因的一段很长且高度保守的内含子上（BONSAI 位点），编码两种mRNA变体，长链变体（IBM1-L）和短链变体（IBM1-S）。IBM-L编码有功能的IBM1蛋白包含jmjC 结构域[24]，有实验证明在met1突变体中由于CG甲基化缺失，短链变体（IBM1-S） 表达量不受影响，长链变体（IBM1-L） 的表达量下调，导致H3K9me2的聚集。同时，ROS1去甲基化酶的活性也受到影响[23，24]。因此，通过控制H3K9去甲基化酶及DNA去甲基化酶活性，形成自我调控的回路维持CG甲基化及组蛋白修饰。

3.8 EDM2（Enhanced Downy Mildew 2）

染色质调控因子EDM2在阻止转录沉寂和DNA高度甲基化方面起作用，包含植物同源结构域识别活跃的或者受抑制的组蛋白甲基化标志。EDM2通过促进mRNA转录产生3'ployA末端来调控组蛋白H3K9去甲基化酶基因IBM1的表达，一起控制GHG甲基化和转录基因沉寂。edm2突变体与ibm1及DNA糖基化酶三突变体rdd重合上百个高度甲基化区域，其中包括与ROS1靶向区域[25]。研究认为类似于IDM1，EDM2和IBM1可能一起创造合适的染色质环境以便后续ROS1发挥作用，同时还发现EDM2在一些转座子的沉寂方面也有着一定的作用。

4 结语与展望

DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控、染色质结构重塑、RNA干扰、基因组印迹、基因沉默、X染色体不活跃等都属于表观遗传学范畴。其中，DNA甲基化是表观遗传学重要的标志之一，发展了各种方法检测DNA甲基化水平。在拟南芥中主要应用了甲基敏感酶进行核酸杂交（Southern blotting）及酶切PCR（CHOP PCR）检测，单个位点重亚硫酸盐测序（Bisulfite sequencing），染色质免疫共沉淀序列分析（ChIP-seq），全基因组重亚硫酸盐测序（Whole genome bisulfite sequencing）等，为进行相关研究提供了极大便利。目前，研究DNA甲基化对于控制转座子活动、植物生长发育、调节转录基因表达、如X染色体不激活、基因印迹等方面起着重要的生物学作用。对于DNA甲基化机制的研究也逐渐趋于完善，但是对于DNA甲基化与其他表观遗传调控机制如组蛋白修饰，染色质结构等方面的关系仍然不是很清楚，这将是今后研究的一个重点。

与DNA甲基化相反，DNA去甲基化在阻止转录基因沉寂，防止特异位点高度甲基化等方面发挥重要作用。目前，对于DNA去甲基化的研究上不够完善，如ROS1糖基化酶的碱基切除修复机制的下游机制如何进行？是否存在其他独立于ROS1的活跃去甲基化机制及其如何发挥作用等方面尚不清楚。

DNA甲基化的水平主要由甲基化和去甲基化这两个途经来协同调控。因此，有关DNA甲基化及去甲基化研究必将有力地促进表观遗传学的研究进程，进一步提高人们对于表观遗传学的认识，为其将来的应用奠定坚实的基础。

参考文献

[1]薛京伦，汪旭.表观遗传学：原理、技术与实践[M].上海：科学技术出版社，2006：5-6.

[2]李娜，张旸.植物DNA甲基化进展[J].植物生理学报，2012，48（11）：1027-1036 .

[3]He XJ，Chen TP，Zhu JK.Regulation and Function of DNA Methylation in Plants and Animals[J].Cell Res，2011，21（3）：442-465.

[4]Law JA，Jacobsen SE.Establishing，Maintaining and Modifying DNA Methylation Patterns in Plants and Animals[J].Nat Rev Genet，2010，11（3）：204-220.

[5]Henderson IR，Jacobsen SE.Epigenetic Inheritance in Plants[J].Nature，2007（447）：418-424.

[6]Huettel B，Kanno T，Daxinger L，et al.Endogenous Targets of RNA-directed DNA Methylation and Pol IV in Arabidopsis[J].EMBO J，2006（25）：2828-2836.

[7]Zhu JK.Epigenome Sequencing Comes of Age[J].Cell，2008（133）：395-397.

[8]Lister R，O'Malley RC，Tonti-Filippini J，et al.Highly Integrated Single-base Resolution Maps of the Epigenome in Arabidopsis[J].Cell，2008（133）：523-536.

[9]Kankel MW，Ramsey DE，Stokes TL，et al.Arabidopsis MET1 Cytosine Methyltransferase Mutants[J].Genetics，2003（163）：1109-1122.

[10]Du J，Zhong X，Bernatavichute YV，et al.Dual Binding of Chromomethylase Domains to H3K9me2-containing Nucleosomes Directs DNA Methylation in Plants[J].Cell，2012（151）：167-180.

[11]Johnson LM，Bostick M，Zhang X，et al.The SRA Methyl-cytosine-binding Domain Links DNA and Histone Methylation[J].Curr Biol，2007（17）：379-384.

[12]Cui X，Cao X.Epigenetic Regulation and Functional Exaptation of Transposable Elements in Higher Plants[J]. Curr Opin Plant Biol，2014（21）：83-88.

[13]Zhang H，He X，Zhu JK.RNA-directed DNA Methylation in Plants：Where to start？[J].RNA Biol，2013（10）：1593-1596.

[14]Zhang HM，Zhu JK.RNA-directed DNA methylation[J].Curr Opin Plant Biol，2011，14（2）：142-147.

[15]Zheng X，Zhu J，Kapoor A，et al Role of Arabidopsis AGO6 in siRNA Accumulation，DNA Methylation and Transcriptional Gene Silencing[J].EMBO J，2007（26）：1691-1701.

[16]He XJ，Hsu YF，Zhu S，et al.An Effector of RNA-directed DNA Methylation in Arabidopsis is an ARGONAUTE 4- and RNA-binding Protein[J].Cell，2009（137）：498-508.

[17]Zhang H，Ma ZY，Zeng L，et al. DTF1 is a Core Component of RNA-directed DNA Methylation and May Assist in the Recruitment of Pol IV[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2013（110）：8290-8295.

[18]Zhu JK.Active DNA demethylation Mediated by DNA Glycosylases[J].Annu Rev Genet，2009（43）：143-166.

[19]Gong Z，Morales-Ruiz T，Ariza RR，et al. ROS1，a repressor of transcriptional gene silencing in Arabidopsis， encodes a DNA glycosylase/lyase[J].Cell，2002（111）：803-814.

[20]Li Y，Cordoba-Canero D，Qian W，et al. An AP Endonuclease Functions in Active DNA Dimethylation and Gene Imprinting in Arabidopsis[J].PLoS Genet，2015（11）：1004905.

[21]Lang Z，Lei M，Wang X，et al.The Methyl-CpG-Binding Protein MBD7 Facilitates Active DNA Demethylation to Limit DNA Hyper-Methylation and Transcriptional Gene Silencing[J].Mol Cell，2015（57）：971-983.

[22]Wang C，Dong X，Jin D，et al.Methyl-CpG-Binding Domain Protein MBD7 Is Required for Active DNA Demethylation in Arabidopsis[J].Plant Physiol，2015（167）：905-914.

[23]Rigal M，Kevei Z，Pelissier T，et al.DNA Methylation in an Intron of the IBM1 Histone Demethylase Gene Stabilizes Chromatin Modification Patterns[J].EMBO J，2012（31）：2981-2993.

[24]Fan D，Dai Y，Wang X，et al.IBM1，a JmjC Domain-containing Histone Demethylase，is Involved in the Regulation of RNA-directed DNA Methylation Through the Epigenetic Control of RDR2 and DCL3 Expression in Arabidopsis[J].Nucleic Acids Res，2012（40）：8905-8916.

[25]Lei M，La H，Lu K，et al.Arabidopsis EDM2 Promotes IBM1 Distal Polyadenylation and Regulates Genome DNA mMethylation Patterns[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2014（111）：527-532.

[26]Qian W，Miki D，Zhang H，et al.A Histone Acetyltransferase Regulates Active DNA Demethylation in Arabidopsis[J].Science，2012（336）：1445-1448.

[27]Basha E，O'Neill H，Vierling E.Small Heat Shock Proteins and Alpha-crystallins：Dynamic Proteins with Flexible Functions[J].Trends Biochem Sci，2012（37）：106-117.

[28]Hilton GR，Lioe H，Stengel F，et al.Small Heat-shock Proteins：Paramedics of the Cell[J].Top Curr Chem，2013（328）：69-98.

[29]Welsh MJ，Gaestel M.Small Heat-shock Protein Family：Function in Health and Disease[J].Ann N Y Acad Sci，1998（851）：28-35.

[30]Scharf KD，Siddique M，Vierling E.The Expanding Family of Arabidopsis Thaliana Small Heat Stress Proteins and A New Family of Proteins Containing Alpha-crystallin Domains（Acd proteins）[J].Cell Stress Chaperones，2001（6）：225-237.

[31]Qian W，Miki D，Lei M，et al.Regulation of Active DNA Demethylation by an α-crystallin Domain Protein in Arabidopsis[J]. Mol Cell，2014（55）：361-371.

[32]Martinez-Macias MI，Qian W，Miki D，et al. A DNA 3' Phosphatase Functions in Active DNA Demethylation in Arabidopsis[J].Mol Cell，2012（45）：357-370.

[33]Cordoba-Canero D，Morales-Ruiz T，Roldan-Arjona T，et al.Single-nucleotide and Long-patch Base Excision Repair of DNA Damage in Plants[J]. Plant J，2009（60）：716-28.

[34]Cordoba-Canero D，Dubois E，Ariza RR，et al.Arabidopsis Uracil DNA Glycosylase （UNG）is Required for Base Excision Repair of Uracil and Increases Plant Sensitivity to 5-fluorouracil[J].J Biol Chem，2010（285）：7475-7483.

（责任编辑：刘昀）