新疆阿勒泰山地蜱传脑炎疫源地调查

孙 响，张桂林，刘 然，刘晓明，杨靓靓，郑 重，赵 焱

新疆阿勒泰山地蜱传脑炎疫源地调查

孙 响1，张桂林1，刘 然1，刘晓明1，杨靓靓2，郑 重1，赵 焱1

目的 调查新疆阿勒泰山地蜱传脑炎疫源地特征，分离鉴定蜱传脑炎病毒。方法 通过家畜体表捡法采集寄生蜱；利用间接免疫荧光法检测当地健康人群血清中蜱传脑炎病毒IgG抗体；通过将蜱研磨液接种实验小鼠进行病原动物分离；通过接种BHK-21细胞对蜱传脑炎病毒进行分离培养；利用RT-PCR方法对病毒E蛋白基因片段进行扩增和测序，通过序列分析明确病毒系统进化特征。结果 新疆阿勒泰山地白哈巴地区分布有2种蜱，森林革蜱为优势种(55.6%)，其次为边缘革蜱(44.4%)；当地人群蜱传脑炎IgG抗体阳性率5.31%(6/113)；通过动物试验和细胞分离培养，从森林革蜱中分离出一株森林脑炎病毒；对病毒E蛋白基因序列的系统进化分析表明，蜱传脑炎病毒阿勒泰分离株属于远东亚型。结论 首次从病原学上证实新疆阿勒泰山地存在蜱传脑炎疫源地，媒介为森林革蜱，病毒流行株为远东亚型。

蜱传脑炎；蜱传脑炎病毒；疫源地；阿勒泰

蜱传脑炎(Tick-borne encephalitis，TBE)在我国又被称为森林脑炎，是由蜱传脑炎病毒(TBEV)引起的以中枢神经系统病变为主的自然疫源性疾病。临床上多表现为高热、剧烈头痛、恶心、呕吐、嗜睡、意识障碍及脑膜刺激征、肌张力减弱或消失等神经系统病征，重症患者病死率较高。蜱传脑炎经蜱叮咬传播，蜱既是蜱传脑炎病毒的传播媒介，也是其宿主。蜱传脑炎分布横贯亚-欧大陆，根据地理分离株的基因组序列变异性可分3个亚型(Sub-types)，包括为欧洲型、西伯利亚型与远东型[1]。亚型间病毒毒力差异大，欧洲亚型和西伯利亚型的致死率分别为0.5%～2%与6%～8%，而远东型致死率最高，为5%～20%[2]。

蜱传脑炎在我国主要分布在东北林区(内蒙古、黑龙江和吉林)和新疆地区[3]。新疆蜱传脑炎疫源地分布在北天山一带以及阿拉套山南坡[4-5]。阿勒泰山通过血清学证实存在人群蜱传脑炎感染，但未分离出病原体。为进一步调查阿勒泰山地蜱传脑炎疫源地的分布、传播媒介以及流行的病毒株亚型，我们于2011-2013年进行了蜱传脑炎调查。

1 材料与方法

1.1 调查地点 白哈巴地区(东经86°47′，北纬48°41′)地处新疆阿勒泰地区阿尔泰山南麓，平均海拔1 300 m，属北温带大陆性气候。该地区与哈萨克斯坦接壤。为山地森林草原生境，主要是新疆针叶松、西伯利亚落叶松、云杉、冷杉等针叶林，间或与白桦等阔叶林混杂。

1.2 标本采集

1.2.1 蜱标本采集 2011年和2012年4-5月，通过家畜体表捡法采集家畜体外寄生蜱，通过布旗法采集游离蜱。蜱分类鉴定后，死蜱用70%酒精保存，活蜱液氮低温保存。

1.2.2 人群血清标本采集 随机选择当地健康人群，肘静脉采血3～5 mL，分离血清，-20 ℃保存。

1.3 血清TBE IgG抗体检测 采用IFA方法。血清1∶10稀释。TBEV IgG抗体IFA检测试剂盒由欧蒙医学实验诊断股份公司(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG)生产，产品编号No.FI2661-1005G，试剂盒内包括抗原片、羊抗人二抗、阳性对照、阴性对照等。按照使用说明操作。抗原片平衡至室温，加样板每个反应区加入30 μL稀释血清，将抗原片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板对应的凹槽里，室温(18～25 ℃)温育30 min。PBS-Tween缓冲液冲洗抗原片1 s，浸洗5 min。在另一洁净加样板的每个反应区加入25 μL FITC标记羊抗人IgG抗体，将抗原片盖在加样板的凹槽里，室温避光温育30 min；用PBS-Tween缓冲液流水冲洗抗原片1 s，浸洗5 min。甘油/PBS封片。每次实验按说明书加入阳性和阴性对照。荧光信号通过荧光显微镜(Nikon ECLIPSE 80i)观察。阳性参考值血清稀释度≥ 1∶10。

1.4 动物接种分离病原 将液氮保存的100只森林革蜱置于75%酒精中浸泡30 min，灭菌生理盐水漂洗3次，加入含青霉素的PBS研磨破碎，3 000 r/min离心，上清液经0.22 μm 滤器(Pall)过滤除菌。按0.5 mL/只剂量腹腔接种5～8周龄的BALB/c小鼠(购于新疆医科大学实验动物中心)，共接种5只。接种后每日观察小鼠发病情况，发病小鼠濒死前无菌解剖，取肝脾和脑组织，液氮保存。取脑组织研磨上清液继续接种小鼠传代。连续观察3周。

1.5 病毒细胞培养 取发病小鼠脑组织研磨，离心，过滤，取0.5 mL研磨上清液接种BHK-21细胞，37 ℃孵育1 h，培养7～10 d，反复冻融3次，按3 000 r/min离心收集细胞培养上清，再次接种细胞，盲传3代后观察细胞病变现象。BHK-21细胞(Baby hamster kiney-21)经含10%(v/v)胎牛血清(杭州四青)的DMEM培养基(Life technology)传代培养分种于48孔细胞培养板。

1.6 病毒分子生物学鉴定

1.6.1 RNA提取及RT-PCR检测 利用Trizol法对400 μL病变细胞培养上清液进行病毒RNA提取，提取物溶于40 μL DEPC处理的去离子水，置于-70 ℃度冷藏备用。按照一步法RT-PCR试剂盒(Takara)说明书操作，扩增体系为25 μL，其中包括5 μL上清RNA提取物，蜱传脑炎病毒E蛋白特异引物5′-TGG AGC TYG ACA AGA CCT CA-3′与 5′-TCC CAC YAG GAT CTT GGG CAA-3′)各1 μL(10 μmol/L)。扩增条件如下：42 ℃反转录30 min。95 ℃热变性5 min。30轮热循环中，每轮循环95 ℃热变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃扩增90 s，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL扩增产物进行1.7%(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测[6]。

1.6.2 序列比对分析 阳性扩增产物交予上海生工公司进行测序。利用DNAstar 7.0进行测序比对，阳性测序结果提交GenBank。利用MEGA 6软件按Clustal-W方法进行同源分析。

2 结 果

2.1 蜱种类组成 在阿勒泰山地白哈巴地区共采集成蜱2种2 160只，森林革蜱(Dermacentorsilvarum)为优势种，占蜱数量组成的55.6%(1 200/2 160),其次为边缘革蜱(Dermacentormarginatus)，占蜱数量组成的44.4%(960/2 160)。4月中下旬至5月中旬，马体上寄生有大量的蜱。

2.2 人群血清学调查 共检测血清113份，其中男性104份，女性9份，年龄18～69岁，平均年龄25岁。阳性血清6份，阳性率5.31%(6/113)。阳性者均为男性，年龄分布在20至28岁，职业为林区工作人员，16名哈萨克族牧民血清检测无阳性。

2.3 动物病原分离实验结果 一组森林革蜱研磨液接种5只BALB/c小鼠，其中4只发病，发病率80%。1只观察21 d未发病。小鼠接种后7～8 d开始发病，初始症状为拒食、不活泼、毛耸、蜷缩、消瘦，后发展为后肢麻痹、瘫痪、濒死。发病小鼠解剖后发现，肝脾肿大，颅内出血。取发病小鼠脑组织研磨液接种2代BALB/c小鼠，共接种7只。其中发病4只，发病率57.1%；未发病3只。发病症状与一代发病小鼠一致。取二代发病小鼠脑组织提取RNA后进行一步法RT-PCR，黄病毒通用引物及TBEV E基因特异引物均扩增出阳性条带，分别为250 bp及750 bp左右(见图2)。

图1 人血清TBE IgG抗体的间接免疫荧光检测

1: Positive result of flavivirus universal primers (250 bp); 2: Negative result; 3: Positive result of E protein gene primers (750 bp); 4: Negative control; M: DL2000 Marker.

图2 森林脑炎病毒RT-PCR E蛋白基因片段扩增结果

Fig.2 RT-PCR to E protein gene fragment of TBEV

阳性结果测序后序列BLAST分析显示，与我们从新疆博尔塔拉蒙古自治州夏尔希里自然保护区全沟硬蜱和森林革蜱中分离出的TBEV病毒株(JX534167)E蛋白基因核苷酸序列完全相同(100%，737/737)。

2.4 病毒细胞分离及分子生物学鉴定 将发病小鼠脑组织研磨、离心、过滤，上清接种BHK-21细胞，盲传3代后，细胞出现圆缩、脱落等病变现象。病变细胞培养上清液进行病毒RNA提取，利用RT-PCR对蜱传脑炎病毒E蛋白基因片段进行扩增，扩增出特异性条带(约为750 bp)。测序后，与动物实验发病小鼠脑组织RNA扩增阳性序列进行比对，两者核苷酸序列完全相同，为同一条序列。由此，初步认为经过动物接种纯化及细胞分离培养，已分离出阿勒泰白哈巴地区TBEV病毒株。

经比对分析，扩增序列与我们从新疆博尔塔拉蒙古自治州夏尔希里自然保护区全沟硬蜱和森林革蜱中分离出的TBEV病毒株(JX534167)E蛋白基因核苷酸序列相同。与我国东北分离毒株MDJ-01株(JQ650522)、武汉分离株WH2012(KJ755186)序列相似度为99%，与森张株(JQ650523)序列相似度为98%，表明阿勒泰分离毒株(Altai-01)为TBEV远东亚型。

▲Xinjiang-01为分离自夏尔希里自然保护区全沟硬蜱的TBEV病毒株,●Altay-01为本研究分离自阿勒泰白哈巴地区森林革蜱的TBEV病毒株.

▲Xinjiang-01 was TBEV isolated fromIxodespersuleatusfrom Charles Hilary nature reserve;●Altay-01 was TBEV isolated fromDermacentorsilvarumfrom Baihaba area of Altai Mountains.

图3 基于E蛋白基因的Neighbor-joining系统发生树

Fig.3 Phylogenetic analysis of TBEV strain based on E protein gene with neighbor-joining method

3 讨 论

既往对阿勒泰地区的研究在血清学上证实该地区人群中存在蜱传脑炎感染，但未分离出病原体。本研究首次从阿勒泰山白哈巴地区的森林革蜱中分离到TBEV病毒株，从流行病学、血清学、病原学上证实了阿勒泰山地蜱传脑炎疫源地的存在，并证实其病原体为TBEV远东亚型。

蜱传脑炎的分布与媒介蜱的分布密切相关。我国北方地区蜱传脑炎的主要媒介为全沟硬蜱(Ixodespersuleatus)，南方地区主要媒介为卵形硬蜱(Ixodesovatus)，在少数地区森林革蜱(Dermacentorsilvarum)也可作为媒介[7]。新疆北天山以及阿拉套山蜱传脑炎疫源地虽然从全沟硬蜱和森林革蜱中都分离出了蜱传脑炎病毒，但全沟硬蜱为疫源地优势蜱种，因此主要传播媒介为全沟硬蜱。阿勒泰山地蜱传脑炎疫源地与新疆其它疫源地不同，森林革蜱是优势蜱种，未发现全沟硬蜱，因此主要传播媒介为森林革蜱。

血清学检测阳性者均为男性青壮年，在当地有1～5年生活史，职业均为外来林区工作人员，表明该职业人群为TBE感染高危人群。而当地长期生活的16名哈萨克族牧民血清检测未发现阳性。调查中发现，16名牧民中仅1人有蜱叮咬史。不同人群血清阳性率的差异可能与蜱的叮咬习性、病毒致病性、人群敏感性及人群防护措施的差异有关，需要进一步的流行病学调查分析加以证实。

在新疆地区境内，除了本研究从阿勒泰山地白哈巴地区分离到TBEV病毒株外，我们还曾从夏尔希里自然保护区分离到4株TBEV病毒株[4]。两地区在地理位置、生境、媒介蜱种等方面均存在差异。白哈巴地区属阿勒泰山脉，主要生境为山地森林草原，森林革蜱为优势蜱种，而夏尔希里自然保护区地处北天山西段阿拉套山南坡，属天山山脉，主要生境为针阔叶混交林，全沟硬蜱为优势蜱种。但基于E蛋白基因的序列比对分析显示，阿勒泰白哈巴分离株与夏尔希里分离株E蛋白基因片段无碱基差异。提示新疆境内分布流行的TBEV遗传基因可能比较稳定，地区间未发生变异。

从全球来说，TBEV主要在一个带状区域内分布流行，这个区域从西欧向东跨越俄罗斯、中国、蒙古直至日本。我国的新疆、内蒙古和东北地区均位于这个流行带内[8-9]。通过对系统发育树分析，新疆Altai-01 TBEV分离株与东北分离株(GenBank注册号JQ650522)的相似度达99%，与蒙古TBEV-MN-2008分离株(HM133639)序列相似度仅为88%，但均为TBEV远东亚型[10]；而新疆周边地区如俄罗斯新西伯利亚(Novosibirsk)Vasilchenko分离株(M97369)、伊尔库茨克市(Irkutsk) Aina分离株(AF091006)、蒙古国境内MucAr M14/10 (JF274481)分离株、吉尔吉斯斯坦境内KY09分离株(HM641235)均为TBEV西伯利亚亚型[1,10-12]。由此可见新疆TBEV病毒株与地理距离较远的东北TBEV病毒株有共同的祖先，而与地理距离相对较近的俄罗斯、吉尔吉斯斯坦、蒙古地区TBEV病毒株却并不同源；提示新疆地区与东北地区之间存在着TBEV传播感染的自然循环，而鸟类的迁徙在病毒的远距离传播中可能起到了重要作用[13]。

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Tick-borne encephalitis endemic foci in Altai Mountains, Xinjiang, China

SUN Xiang1,ZHANG Gui-lin1,LIU Ran1,LIU Xiao-ming1,YANG Liang-liang2,ZHENG Zhong1, ZHAO Yan1

(1.CenterforDiseasePreventionandControlofXinjiangMilitaryCommandRegion,Urumuqi830011,China; 2.PLA16thHospital,Altai836599,China)

In order to investigate endemic region of tick-borne encephalitis in Altai Mountains of Northern Xinjiang and to isolate and characterize viral geographic strains, we collected 2 160 ticks from Baihaba area located in Altai Mountains with searching for hosts and 113 serum of local healthy residents. The detection of TBEV specific IgG antibodies from serum were performed by indirect fluorescent assay (IFA), and viruses were isolated from ticks samples by inoculating BALB/c mice and BHK-21 cells. The virus E protein gene fragments were amplified and sequenced using the RT-PCR method. Results showed thatDermacentorsilvarum(55.6%) were dominant species followed byDermacentormarginatus(44.4%). TBEV specific-IgG antibodies in serum were positive with the rate of 5.31% (6/113). ATBEV strain was isolated fromDermacentorsilvarumafter animal inoculation and cells culture. E protein gene alignment sequence and phylogenetic analyses showed that the virus was clustered into TBEV far-eastern sub-type. Results demonstrated a novel endemic foci of tick-borne encephalitis was firstly described in Altai Mountains, northern Xinjiang. The TBEV geographic isolates were belonged to TBEV far-eastern subtype.Dermacentorsilvarumplayed a crucial role for transmitting the disease.

tick-borne encephalitis; tick-borne encephalitis virus; endemic foci; Altai Mountains

Zhang Gui-lin, Email:xjglzhang@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.021

国家自然科学基金项目(No.U1303104)

张桂林，Email:xjglzhang@126.com

1.新疆军区疾病预防控制中心，乌鲁木齐 830011； 2.新疆军区第十六医院，阿勒泰 836599

R384.4

A

1002-2694(2015)12-1189-04

2015-03-18；

2015-09-23

Supported by grants from the National Natural Science Fundation (No. U1303104)