青贮饲料用乳酸菌的高密度培养优化

焦月华，张 爽，黄晓峰，姜 波，赵良友

（1.黑龙江省中医药大学药物安全性评价中心，哈尔滨 150040；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；3.黑龙江生物科技职业学院，哈尔滨 150025）

青贮饲料是把青饲料切碎后装入青贮塔或青贮窖内密封，添加乳酸菌发酵剂或酶制剂后，发酵制成。青贮饲料的质量直接影响反刍动物的生产性能，而青贮饲料中乳酸菌对其质量起决定作用。国外许多研究者对乳酸菌在青贮饲料制备中的作用和应用进行了大量深入的研究[1-2]。而我国在青贮添加剂技术的研究与应用方面十分薄弱，在东北地区乳酸菌添加剂在全株玉米青贮饲料中的应用尤其少见。直投式发酵剂是一种不需要经过活化和扩培便能直接应用于生产的发酵剂，具有保藏周期长、活菌数高和质量稳定等优点，能够提高应用效率和产品质量[3]。在乳制品工业的实际生产过程中，通常选用以脱脂乳粉或乳清粉作为主要成分的增殖培养基来生产用于乳制品发酵的直投式发酵剂，这样能够有效改善菌种因适应新环境而导致的生长迟缓，例如可以利用乳清粉或者乳清渗出液作为基础培养基，通过补充一些碳源、氮源以及缓冲盐类作为增殖培养基来进行大规模的生产。乳清作为干酪生产的副产物，主要成分是大量的乳糖和乳清蛋白，此外还含有丰富的必需氨基酸、矿物质和B族维生素，不但能够满足乳酸菌的生长需要，而且来源广泛、价格低廉，非常适合作为工业化原料来生产乳酸菌发酵剂[4]。目前，国内外已有大量关于以廉价乳清基质作为乳酸菌增殖培养基的主要成分来生产乳制品发酵剂的报道，但是利用其来生产青贮用乳酸菌发酵剂仍鲜有报道[5-6]。本研究以前期从黑龙江省内采集的自然发酵优质青贮饲料中分离并筛选得到的1株优良植物乳杆菌（Lp1）作为研究对象，以乳清作为基础培养基制备菌体细胞的浓缩培养物，优化发酵条件的同时采用单因素和正交实验，比较额外添加的碳源和氮源对乳酸菌增殖的影响，从而为青贮饲料用乳酸菌直投式发酵剂工业用培养基的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌株来源

植物乳杆菌Lp1分离自优质的青贮玉米饲料，经前期试验已初步确定具有较强的产酸能力和产酸速率，可用于青贮饲料制作。

1.1.2 试剂和培养基

乳清粉购自新西兰，酵母粉、酪蛋白胨购自英格兰Oxoid公司，谷氨酸钠、L-半胱氨酸盐酸、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司，葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，Tween-801 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，柠檬酸氢二铵2 g，磷酸氢二钾2 g，蒸馏水1 L，pH 5.8～6.0，121℃灭菌15 min[7]。

6%（W/V）乳清培养基：乳清粉6 g溶于70℃100 mL蒸馏水中，用1 mol·L-1HCL调至pH 4.5，室温下经8000 rpm，高速离心30 min除去析出的酪蛋白，澄清的乳清液再用1 mol·L-1NaOH调回pH 6.5，110℃灭菌10 min备用。

6%（W/V）乳清培养基+0.75%磷酸盐培养基：在6%（W/V）乳清培养基中加入0.75%磷酸盐，其中磷酸盐溶液为KH2PO4∶Na2HPO4=1∶1（V/V），110℃灭菌10 min备用[8]。

1.1.3 仪器和设备

超速冷冻离心机GL-21M购自上海离心机械研究所；培养箱DHP-P272购自上海一恒科学仪器有限公司；光学显微镜购自美国OLMPUS；超净工作台VD-1320购自哈东联仪器设备制造公司；核酸/蛋白质分析仪DU-800购自美国Beckman。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化

将实验室保存的植物乳杆菌Lp1接入到MRS液体培养基中，在37℃下培养，每24 h传代1次，均按照1.5%接种量接种，活化两次。

1.2.2 发酵条件优化

将活化后的植物乳杆菌Lp1以3%（v/v）的接种量接种到MRS培养基中培养8 h，通过测定OD600nm来比较不同温度（37、42、45℃）及初始pH（pH 5.8、pH 6.2、pH 6.6）对其增殖效果的影响。

1.2.3 碳氮源对乳酸菌生长的影响

比较碳氮源种类对植物乳杆菌Lp1生长的影响，在6%乳清+0.75%磷酸盐培养基中分别添加0.7%（W/V）氮源（大豆蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白胨）或2%（W/V）的碳源（蔗糖、乳糖、葡萄糖），以活菌数来反映不同碳氮源种类对植物乳杆菌Lp1增殖效果的影响[9]。

1.2.4 发酵培养基优化

考虑到营养物质之间存在的联合协同作用，在6%乳清培养基的基础上，采用3因素3水平的正交实验法对培养基成分进行优化，其中碳源和氮源的因素水平设计根据前面的研究结果确定。另外，根据文献选择酵母粉作为第3个因素[8,10-11]。通过活菌数来确定最佳的增菌培养基配方。

1.2.5 菌体培养和活菌计数方法

将植物乳杆菌Lp1以3%（V/V）的接种量接种到培养基中，在37℃下培养14 h（稳定期初期）后，利用梯度稀释平板活菌计数法，将涂布后的平板放置于37℃恒温培养箱中培养48 h后计活菌数[12]。

1.3 统计分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 培养条件对增殖效果的影响

温度对乳酸菌增殖的影响见图1。

图1 温度对乳酸菌增殖的影响

微生物的生长繁殖是一系列生化反应的结果，菌株的生长速率和酶活性与培养温度具有一定的依存关系，使得发酵的最适温度随菌株的不同而不同。由图1可见，乳酸菌在37～45℃温度范围内生长均有2 h的生长迟滞期，尤其是经37℃培养时的生长曲线低于45℃培养（P＜0.05），8 h时，在42和45℃下培养的菌体细胞的吸光度几乎没有差别，因此出于节约能源的角度考虑，选择42℃作为植物乳杆菌Lp1高密度培养的温度。

初始pH对乳酸菌增殖的影响见2。

图2 初始pH对乳酸菌增殖的影响

由图2可知，乳酸菌在不同初始pH培养环境下的增殖趋势为：前0～2 h内均处于生长迟滞期，此后乳酸菌一直呈现快速生长状态。虽然乳酸菌经初始pH 6.2～6.6培养的生长速率显著高于初始pH 5.8培养时的生长速率（P＜0.05），但是当培养基初始酸度高于pH 6.2时，乳酸菌的增殖趋势并没有显著升高（P＞0.05）。因为植物乳杆菌Lp1将来作为青贮饲料发酵剂使用，为了让其能够迅速适应青贮饲料的酸性环境而开始快速增殖，从而抑制腐败菌的生长，植物乳杆菌Lp1高密度增殖培养基的酸度调节为pH 6.2比较适合。

2.2 不同碳源对乳酸菌生长的影响

不同碳源对植物乳杆菌Lp1增殖的影响见图3。

图3 不同碳源对植物乳杆菌Lp1增殖的影响

如图3所示，蔗糖的增殖效果显著低于乳糖和葡萄糖（P＜0.05），这是由于大多数的乳酸菌不具有分解二糖和多糖等大分子碳水化合物相关酶系的能力。葡萄糖是绝大多数乳酸菌最容易吸收和利用的单糖，植物乳杆菌Lp1也不例外，同时，葡萄糖和乳糖都能够显著地促进植物乳杆菌Lp1的增殖（P＜0.05）。

2.3 不同氮源对乳酸菌生长的影响

不同氮源对植物乳杆菌Lp1增殖的影响见图4。

图4 不同氮源对植物乳杆菌Lp1增殖的影响

由图4可知，植物乳杆菌Lp1最适宜的氮源为牛肉膏，而蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨和胰蛋白胨的增菌效果相近。这是由于牛肉膏中含有多种核苷酸、多肽、有机酸和具有高缓冲能力的磷酸盐等营养物质，有利于满足微生物生长多方面的要求[13]。考虑到成本，选择价格较低廉的蛋白胨和大豆蛋白胨，这两种氮源的增菌效果也较好，植物乳杆菌Lp1的活菌数达1.02×109cfu·mL-1。

2.4 发酵培养基优化

优化培养基的正交实验结果见附表。

附表 优化培养基的正交实验结果

由附表可知，影响Lp1的主次顺序是B＞A＞C，蛋白胨的效果最佳，葡萄糖次之，影响最小的为酵母粉，最佳保护剂配方为A3B3C3，但是优化出的最优组合未出现在正交实验组，为了进一步确定正交实验的准确性，在相同条件下，对A3B3C3组合与A3B3C2组合进行1次验证实验。结果表明，植物乳杆菌Lp1的活菌数为3.23×109cfu·mL-1，高于试验组的最高活菌数，因此确定A3B3C3为最佳的培养基配方组合，即6%乳清、3%葡萄糖、1.0%蛋白胨和1.0%酵母粉（均为W/V）。

3 讨论

乳酸菌直投式发酵剂的相关研究在国内已经不是一个新兴的领域，但是国内的食品行业所使用的直投式发酵剂都被外资企业所垄断[14]。因此，生产出优良的具有自主知识产权的直投式发酵剂，不仅能够打破国外企业的技术壁垒，还因其较低的成本具有巨大的市场潜力[15]。在发酵结束之后，乳酸菌的菌数越多，经过浓缩和冻干损失之后的直投式发酵剂中的活菌数才会越高，因此，高密度发酵是决定直投式乳酸菌发酵剂质量的重要因素[16]。乳清粉作为干酪生产过程中的副产品，其来源广泛、价格低廉[17]。许多研究表明，乳清粉可作为乳酸菌增殖培养基的主要成分进行大规模工业化生产，能够获得高浓度的菌体细胞，并且显著降低生产成本（P＜0.05）[5-6,8]。由于其主要成分是乳清蛋白和乳糖，而乳酸菌的大量增殖需要许多生长因子，且乳清培养基的pH缓冲能力也稍弱，因此，作为乳酸菌高密度培养的增殖培养基需加入缓冲盐类，从而将发酵液的酸度控制在一定范围内，同时需要根据不同乳酸菌菌株的具体营养需求添加适宜的生长因子和额外的碳氮源等其他成分，以利于菌体细胞的大量增殖而获得高浓度的菌体培养液[18]。酵母粉中含有大量辅酶与核酸的组成成分，例如氨基酸类、肽类和B族维生素等，有利于乳酸菌菌株的快速高密度增殖[13]。Dean等发现，在乳清中添加1%酵母粉（W/V）能够显著增加德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842的β-半乳糖苷酶的活力，从而促进其对乳糖的分解，提高发酵液中的活菌数（P＜0.05）[19]。陈雪等研究发现，向乳清培养基中添加酵母粉和酶水解酪蛋白能够显著提高发酵液中乳酸乳球菌菌株KLDS 4.0424的活菌数（P＜0.05）[6]。因此，本研究也利用6%的乳清磷酸盐缓冲液培养基，选择通过添加酵母粉、葡萄糖和蛋白胨来制备植物乳杆菌Lp1的增菌培养基，达到了较好的结果。

4 结 论

通过单因素和正交实验筛选出最佳的增菌培养基的成分为6%乳清、3%葡萄糖、1.0%蛋白胨和1.0%酵母粉，发酵液中的活菌数能够达到3.23×109cfu·mL-1。

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