环磷腺苷效应元件结合蛋白磷酸化在胰岛素样生长因子-1抑制耳蜗毛细胞凋亡中的作用

宫 亮 陈 冬 李 里

(辽宁医学院附属第一医院耳鼻咽喉科，辽宁 锦州 121000)

环磷腺苷效应元件结合蛋白磷酸化在胰岛素样生长因子-1抑制耳蜗毛细胞凋亡中的作用

宫 亮 陈 冬 李 里1

(辽宁医学院附属第一医院耳鼻咽喉科，辽宁 锦州 121000)

目的 探讨磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(P-CREB)对胰岛素样生长因子(IGF)-1抑制小鼠毛细胞凋亡的作用。方法 体外培养新生小鼠耳蜗基底膜。实验分为A组：正常对照培养液；B组：庆大霉素(GM)(0.5 mmol/L)；C组：GM(0.5 mmol/L)+IGF-1(1 ng/ ml)；D组：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(10 ng/ ml)；E组GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(50 ng/ ml)；F组：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(100 ng/ ml)。培养24 h后收集细胞及固定。应用TUNEL法观察各组耳蜗毛细胞的凋亡情况。应用Western印迹及RT-PCR法观察P-CREB的表达情况。结果 A组无凋亡细胞。B组检测到凋亡细胞。C组细胞凋亡较B组明显减少。D组凋亡细胞减少最明显(与B组相比，P<0.05)。E组及F组凋亡细胞较D组有所增加。P-CREB：Western印迹结果及RT-PCR结果表明：A组及B组P-CREB蛋白及mRNA表达较低。与B组相比，C、D、E及F组P-CREB蛋白及mRNA明显增加，以D组增加最明显。结论 IGF可能通过激活CREB磷酸化抑制毛细胞凋亡。

毛细胞；凋亡；胰岛素样生长因子；磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(P-CREB)

环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)属于cAMP反应元件结合蛋白，其调节的经典通路为G 蛋白-cAMP-PKA 通路。该通路主要是磷酸化激活CREB；激活的CREB之间形成同源二聚体或和其他蛋白结合形成异源二聚体，后与真核生物启动子中的CRE 结合对CREB 靶基因转录进行调控。胰岛素样生长因子(IGF)-1是一种调控耳蜗生长发育及细胞间协调稳定的生长因子。目前对于IGF-1在神经细胞损伤防护中的研究较为深入，但在耳蜗发育过程中及其在耳蜗毛细胞和螺旋神经节中保护作用及其机制仍不明确。研究表明IGF-1可以抑制小鼠耳蜗毛细胞凋亡。Lebesgue等〔2〕研究表明：CREB磷酸化(P-CREB)后可以上调Bcl-2，进而抑制海马椎体细胞凋亡。P-CREB参与抑制神经细胞，肿瘤细胞和肾脏细胞等多种细胞凋亡〔3〕。本文探讨IGF-1抑制凋亡的作用与P-CREB关系。

1 材料与方法

1.1 材料 小牛血清购自美国标准生物品收藏中心，TUNEL 检测试剂盒购自美国Clontech公司，RT-PCR 试剂盒购自美国Qiagen 公司，IGF-1 由美国Genentech 公司惠赠，抗p-CREB抗体及二抗购自美国Santa Cruz 公司。

1.2 细胞培养及分组 耳蜗基底膜进行离体培养24 h后更换培养液。实验分为A组：正常对照培养液；B组：庆大霉素(GM)(0.5 mmol/L)；C组：GM(0.5 mmol/L)+IGF-1(1 ng/ ml)；D组：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(10 ng/ ml)；E组GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(50 ng/ ml)；F组：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(100 ng/ ml)。24 h后吸出培养液，再用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定样品4 h以上，制作各组耳蜗组织铺片。

1.3 耳蜗毛细胞凋亡检测 对各组耳蜗基底膜细胞进行TUNEL染色，加入脱氧核苷酸末端转移酶混合液；阳性对照用DNA酶I，分别以50 mg/L，0.1 g/L，0.5 g/L和1.0 g/L预处理组织，应用多聚甲醛固定后，将其置于穿透液中，阳性结果为细胞核红染。激光共聚焦显微镜下观察。

1.4 Western印迹检测P-CREB蛋白的表达 收集细胞，提取总蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，应用增强化学发光法检测P-CREB蛋白表达。应用HPlsA 1000图文分析系统分析胶片，用P-CREB与β-actin灰度值的比值表示P-CREB的相对表达量。

1.5 P-CREB mRNA表达检测 采用RT-PCR技术，Access RT-PCR系统将提取的1 μg总RNA扩增成DNA目的片段。反应循环参数：55℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。P-CREB引物：5' GGATCCACGAGCAGAGTCCC 3；5' CCGCCAACCAAGTTCAAGTTCACAGG 3'，235 bp；内参照β-actin：5'CCGTTGACATCCGTAAAGAC 3'，5' GCCGGTGGACAGTGAGGC 3'，200 bp。P-CREB的相对表达水平为P-CREB与β-actin的灰度比值。

1.6 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件进行t检验和Pearson相关分析。

2 结 果

2.1 各组细胞凋亡情况 B、C、D、E、F组加入GM后底回和中回基底膜均存在TUNEL染色阳性细胞，而A组未发现。加入IGF-1后，各组中回和底回毛细胞和螺旋神经节TUNEL染色阳性细胞要明显少于B组。不同浓度IGF-1都可以有效抑制GM对离体培养的小鼠耳蜗基底膜细胞的凋亡过程，10 ng/ml IGF-1是体外培养HC及SGC的最佳药物浓度。超过该浓度后凋亡细胞数要显著增高。见图1、表1。

图1 各组凋亡细胞观察(×400)

2.2 耳蜗毛细胞P-CREB蛋白及mRNA相对表达量 A组及B组P-CREB蛋白及mRNA表达较低。与B组相比，C、D、E组及F组P-CREB蛋白及mRNA明显增加，以D组增加最明显。见图2、表1。

2.3 相关性分析 凋亡细胞率与P-CREB蛋白及mRNA呈负相关(r=-0.987，-0.979，均P<0.05)。

表1 各组细胞凋亡率、细胞P-CREB蛋白及mRNA相对表达量

与A组相比：1)P<0.05；与B组相比：2)P<0.05

图2 各组P-CREB蛋白表达

3 讨 论

听力功能下降的主要原因为耳蜗毛细胞凋亡〔4〕。研究表明敲除IGF-1基因的鼠在内耳生长发育期出现细胞凋亡〔5〕，同时听力出现减退，这说明IGF-1可以在一定程度上调节内耳毛细胞凋亡〔6〕。Lakhani等〔7〕发现IGF-1可以减少耳蜗毛细胞凋亡。前期结果表明〔1〕，IGF-1使GM诱导的小鼠耳蜗毛细胞凋亡明显减少，进而保护耳蜗毛细胞，但机制不清楚。

CREB在细胞核存在，CREB分子Ser133位点被磷酸化刺激后，CREB具有了转录活性，同时与CBP结合后与基础转录复合物之间通过相互作用从而进行靶基因转录，CBP只能与P-CREB结合，故未磷酸化CREB不能完成转录功能。Peruzzi等〔8〕研究表明，IGF-1作用于神经细胞时P-CREB增加，未磷酸化的CREB蛋白无变化，表明IGF-1保护神经细胞时通过使P-CREB具有转录活性进而调控转录。

本文研究结果说明GM导致毛细胞凋亡并致耳蜗毛细胞损伤。IGF-1可以抑制毛细胞凋亡。应用IGF-1后细胞的凋亡减轻，说明IGF-1有抑制凋亡的作用，同时出现P-CREB明显升高，说明在IGF-1抑制凋亡的过程中 CREB出现磷酸化。

1 Guan J.Insulin-like growth factor-1(IGF-1)derived neuropeptides，a novel strategy for the development of pharmaceuticals for managing ischemic brain injury[J].CNS Neurosci Ther，2011;17(4)：250-5.

2 Lebesgue D，Vivien Chevaleyre V，Zukin RS，etal.Estradiol rescues neurons from global ischemia induced cell death：multiple cellular pathways of neuroprotection〔J〕.Steroids，2009;74：555-61.

3 熊 果，马康华.cAMP反应元件结合蛋白(CREB)与细胞凋亡〔J〕.基础医学与临床，2011;31(3)：328-30.

4 Hoang Dinh E，Ahmad S，Chang Q，etal.Diverse deafness mechanisms of connexin mutations revealed by studies using in vitro approaches and mouse models〔J〕.Brain Res，2009;1277：52.

5 Camarero G，Villar MA，Contreras J，etal.Cochlear abnormalities in insulin-like growth factor-1 mouse mutants〔J〕.Hear Res，2002;170：2-11.

6 Savage MO，Camacho-Hubner C，Dunger DB.Therapeutic applications of the insulin-like growth factors〔J〕.Growth Horm IGF Res，2004;14：301-8.

7 Lakhani SA，Masud A，Kuida K，etal.Caspases 3 and 7：key mediators of mitochondrial events of apoptosis〔J〕.Science，2006;311：847-51.

8 Peruzzi，M Prisco，A Morrione，etal.Antiapoptotic signaling of the insulin-like growth factor-I receptor through mitochondrial translocation of c-Raf and Nedd4〔J〕.J Biol Chem，2001;276：25990-6.

〔2013-12-18修回〕

(编辑 苑云杰)

辽宁省教育厅高等学校科研项目(2014A460)

陈 冬(1972-)，男，教授，博士，主要从事头颈恶性肿瘤研究。

宫 亮(1980-)，男，主治医师，硕士，主要从事头颈恶性肿瘤研究。

R76

A

1005-9202(2015)12-3246-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.026

1 辽宁医学院附属第一医院风湿科