ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制

张风华 彭和平 王宝枝

(广州医科大学附属第四医院普外科，广东 广州 511447)

ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制

张风华 彭和平 王宝枝

(广州医科大学附属第四医院普外科，广东 广州 511447)

目的 探讨ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制。方法 将ART1-shRNA转入到小鼠结肠癌CT26细胞，置于荧光显微镜下观察该病毒的转染效率；采用RT-PCR和Western印迹法鉴定ART1基因沉默的效果；采用侵袭实验及黏附实验观察CT26细胞受ART1基因沉默的影响，并采用明胶酶谱法测定对该细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白活性的影响。结果 病毒感染4 d后ART1 mRNA 的表达量在ART1-shRNA 组中明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。ART1-shRNA组CT26细胞的ART1蛋白的表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。ART1-shRNA组CT26细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)；ART1-shRNA组的侵袭抑制率与阴性对照组和空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组和空白对照组相比，RT1-shRNA 组CT26细胞与纤维连接蛋白的黏附能力均明显降低(P<0.01)。RT1-shRNA 组CT26细胞中RhoA/Rho相关螺旋卷曲形成蛋白激酶(ROCK1)、RhoA、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。结论 ART1基因沉默能够导致小鼠结肠癌CT26细胞的侵袭和黏附力降低，可能与ART1基因沉默后ROCK1、RhoA、MMP-2、MMP-9的表达水平下调有关。说明ART1基因在结肠癌的侵袭和转移中具有重要作用。

结肠癌；ART1基因；Rho相关激酶类；CT26细胞

腺苷二磷酸(ADP)核糖转移酶ART1对蛋白质精氨酸残基的单-ADP-核糖基化作用起到特异性催化效果，且在人、小鼠、大鼠中均有表达〔1〕。间位碘代苄胍(MIBG)为ART1的特异性抑制剂。相关研究显示，结肠癌组织中ART1蛋白的表达明显高于正常肠黏膜组织，且与整合素(αVβ3)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达之间有明显的相关性〔2〕。本研究拟探讨ART1基因沉默后对CT26细胞中RhoA/Rho相关螺旋卷曲形成蛋白激酶(ROCK)1、RhoA、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达的影响，及其对结肠癌侵袭力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 小鼠结肠癌CT26细胞购于上海通派生物科技有限公司；RPMI 1640培养液购于美国CORNING公司；胎牛血清购于美国SIGMA公司；ART1基因直接转染的病毒载体购于上海吉凯基因公司；RT-PCR试剂盒购于上海江莱生物科技有限公司；青链霉素双抗，兔抗小鼠多克隆ART1、ROCK1、RhoA、MMP-2、MMP-9、β-actin抗体，均购于上海博湖生物科技有限公司；增强化学发光试剂盒购于德国merck公司；明胶、TritonX-100、八肽胆囊收缩素(CCK-8)均购于上海江莱生物科技有限公司。

1.2 细胞培养及ART1-shRNA转染 用含10%的胎牛血清RPMI1640培养液培养小鼠结肠癌CT26细胞。实验分为vshART1慢病毒载体(ART1-shRNA组)、negative-shRNA 慢病毒载体(阴性对照组)、未转染组(空白对照组)。转染过程严格按照说明书进行，取对数生长期CT26细胞，每孔接种3×104个细胞，观察细胞生长的融合度达到50%之后，按照MOI值为20时，每孔中分别加入慢性病毒1×108TU/ml进行感染，4 d后观察转染情况。

1.3 ART1基因沉默情况鉴定 采用RT-PCR进行鉴定，各组均取感染4 d后的细胞，用Trizol试剂盒提取各组细胞的总RNA，反转录为cDNA，进一步扩增对ART1 mRNA的表达情况；扩增产物采用凝胶电泳进行鉴定，并在凝胶成像仪中拍照。

1.4 细胞侵袭实验 8 μm孔的小室采用Matrigel包被，放于4℃环境中过夜；向下室中加入500 μl浓度为10%的胎牛血清，上室中加入200 μl含5×105个细胞的悬液，培养24 h后，将上室细胞弃去，细胞固定后用结晶紫染色，随机选取5个视野，计数完整细胞。本次实验各组均设置3个复室。

1.5 细胞黏附实验 10 mg/L浓度的纤维连接蛋白包被96孔板，4℃条件下放置12 h。用含有1%胎牛血清白蛋白的封闭液在室温条件下封闭2 h，使用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度，重复实验3次，计算细胞黏附抑制率。

1.6 明胶酶谱 取三组对数生长期的CT26细胞分别接种于6孔板中，当细胞生长至80%及以上时，换用无血清培养液培养1 d，取上清，4℃条件下离心15 min，置于-80℃超低温冰箱中保存待测；确保三组质量相等后，4℃环境下行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)恒压电泳，电压设定为100 V，取含72 kD、92 kD的凝胶放入3.0%TritonX-100的洗脱液中，洗脱完全后放入孵育液中42 h，考马斯亮蓝染色后采集图像，均重复进行3次。

1.7 Western印迹检测蛋白表达 抽提结肠癌CT26细胞中蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。调整三组蛋白总量一致后行SDS-PAGE电泳，分离蛋白，湿转至聚偏二氟乙烯膜上，用含有5%的脱脂奶粉在室温条件下密封保存1 h，加入一抗，4℃反应12 h，采用Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜后加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗，4℃反应1 h，分析条带灰度值并计算内参与各蛋白的灰度值之比，均重复3次。

1.8 统计学方法 应用SPSS16.0软件行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1 ART1基因沉默效率鉴定 病毒感染4 d后，ART1-shRNA 组、阴性对照组均获得稳定转染的细胞，细胞中GFP水平均达≥80%。RT-PCR检测显示，ART1-shRNA 组细胞中ART1 mRNA 表达量(0.021±0.009)明显低于阴性对照组(0.246±0.081)和空白对照组(0.298±0.069)(P<0.01)。Western印迹检测显示，ART1-shRNA 组的CT26细胞的ART1蛋白的表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。见图1。

2.2 ART1基因沉默对CT26细胞中ROCK1、RhoA、MMP-2、MMP-9蛋白表达影响 如图2所示，RT1-shRNA组CT26细胞中ROCK1、RhoA、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。

2.3 ART1基因沉默对CT26细胞侵袭力影响 ART1-shRNA组CT26细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)；ART1-shRNA组与阴性对照组和空白对照组相比侵袭抑制率分别为40.02%、43.64%(P<0.05)。

2.4 ART1基因沉默对CT26细胞黏附能力的影响 ART1-shRNA组CT26细胞与纤维连接蛋白的黏附抑制率为41.572%，阴性对照组黏附抑制率3.148%。ART1-shRNA 组CT26细胞与纤维连接蛋白的黏附能力明显低于阴性对照组与空白对照组(P<0.01)。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：ART1-shRNA组

图3 三组CT26细胞侵袭力情况(×200)

3 讨 论

ART1能够对人防御素-1、整合素α7β1、(FGF)-2、(PDGF)-BB四种蛋白进行直接修饰，其中人防御素-1、FGF-2、PDGF-BB为分泌性蛋白，主要与机体中血管生成、免疫反应、细胞生长相关；整合素α7β1为跨膜蛋白的一种〔3〕。相关研究认为，整合素α7β1为能够诱导MCF-7乳腺癌细胞的侵袭、转移，还与黑色素细胞恶性转化相关〔4〕。整合素β1结合胞外基质后可上调RhoA，进一步将RhoA/ROCK通路激活〔5〕。

Rho家族为Ras超家族，RhoA为其中一个重要组成，ROCK1是Ras超家族的下游效应因子。细胞骨架和RhoA/ROCK通路之间存在密切关系，可对细胞运动能力造成明显影响〔6〕。MMP-2、MMP-9能够使细胞外基质降解，促进肿瘤的转移和侵袭能力。研究显示，用ROCK抑制剂对膀胱癌细胞进行处理，能够通过下调MMP-2、MMP-9表达来抑制RhoA对TSGH 细胞迁移的诱导作用〔7〕，提示激活RhoA/ROCK通路能够使MMP-2、MMP-9表达上调。本研究说明ART基因沉默可下调ART1的表达水平，进一步下调MMP-2、MMP-9的表达，使活性下降，进而对结肠癌CT26细胞的迁徙和侵袭能力产生了明显影响。以上结果的可能机制与抑制RhoA/ROCK通路有关，但其能否通过降低对整合素α7β1的翻译后修饰，进而影响下游通路MMP-2、MMP-9、RhoA/ROCK的表达，还需要进一步深入研究。

1 徐剑侠.ART1对小鼠结肠癌CT26细胞增殖的影响及其相关机制探讨〔D〕.重庆：重庆医科大学硕士论文，2013.

2 熊 薇,唐 怡,王娅兰,等.ART1基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附和运动能力的影响〔J〕.复旦学报(医学版),2013;40(3):328-34.

3 董天庚,牛伟新,洪信强,等.联合激动Toll样受体的树突细胞对小鼠结肠癌生长的影响〔J〕.中华实验外科杂志,2012;29(2):181-3.

4 蔡 莉,王娅兰,林 晓,等.PARP抑制剂5-AIQ对小鼠结肠癌CT26细胞PARP/NF-κB复合物和NF-κB活性的影响〔J〕.基础医学与临床,2008;28(11):1156-9.

5 杨 怡,王娅兰,王洁琼,等.PARG基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞肝转移影响〔J〕.基础医学与临床,2012;32(10):1132-6.

6 吴伟强,王娅兰,潘 娟,等.PARG基因沉默抑制小鼠结肠癌CT26细胞系体外淋巴管形成〔J〕.基础医学与临床,2011;31(6):625-9.

7 李 喆,赵 平,王建军,等.核糖核酸干扰抑制生存素表达诱导小鼠结肠癌细胞凋亡〔J〕.中华实验外科杂志,2006;23(7):792-4.

〔2014-07-16修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

张风华(1975-)，女，硕士，主治医师，主要从事结肠癌治疗基础研究。

R735

A

1005-9202(2015)12-3233-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.020