螺虫乙酯对斑马鱼的急性毒性及细胞凋亡的影响

李江等

摘 要 螺虫乙酯作为一种结构新颖、作用机制独特和广谱高效的季酮酸类衍生物杀虫杀螨剂，在农业生产中普遍应用，随着用量的增加，对水生生物会造成一定的影响。采用经济合作与发展组织（OECD）方法在预试验基础上设螺虫乙酯2.5、2.97、3.54、4.20、5.00 mg/L 5个浓度梯度，研究其对斑马鱼的急性毒性，采用酚-氯仿萃取的方法提取DNA，并进行了优化，用DNA Ladder方法观察其细胞凋亡现象，用Giemsa染色观察其外周血细胞微核率，初步探索其致毒机制。结果表明，螺虫乙酯对斑马鱼72 h的LC50值为5.898 mg/L、96 h的LC50值为3.642 mg/L，属中等毒性；各浓度梯度螺虫乙酯药剂处理后的斑马鱼DNA出现梯状条带，螺虫乙酯染毒后对斑马鱼造成一定程度上的细胞凋亡现象；处理组微核率为（7.250±1.893）～（5.500±0.577），与对照组和溶剂组差异均达显著水平。

关键词 螺虫乙酯 ；斑马鱼 ；急性毒理 ；基因组DNA ；细胞凋亡 ；微核

分类号 S767

Abstract Spirotetramat is a insecticide matricide which has a novel structure and unique mechanism of action and also has broad spectrum keto derivatives. It is widely used in agricultural production which may cause some affected on aquatic organisms with the increasing amount of spirotetramat.We adopted the method of OECD （Organization for Economic Co-operation and Development） and set 5 concentrationgradients of spirotetramat like 2.5，2.97，3.54，4.20，5.00 mg/L to study its acute toxicity on zebra fishes. To preliminarily explore its toxic mechanism， we used phenol-chloroform extraction method to extract DNA which had been optimized， observed the phenomenon of apoptosis by DNA Ladder method and used Giemsa staining micronucleus frequency in peripheral blood cells. Spirotetramated zebra fish 72 h LC50 value is 5.898 mg/L and 96 h LC50 value is 3.642 mg/L. The results show that Spirotetramat is moderately toxic and occured apoptosis phenomenon to some extent on the zebra fish. After each zebrafish DNA concentration gradient Spirotetramat pharmaceutical treatment appeared ladder. Treated micronuclei was （7.250±1.893）～（5.500±0.577）. Compared with control group and solvent group， the differences were reached significant levels.

Keywords spirotetramat ； zebra fish ； acute toxicity ； genomic DNA ； apoptosis ； micronucleus

螺虫乙酯（spirotetramat）是2008年由拜耳作物科学公司开发的一种季酮酸类衍生物杀虫杀螨剂，原药属低毒，原药大鼠急性经口LD50>2 000 mg/kg。大鼠急性经皮LD50>2 000 mg/kg。大鼠吸入LC50>4 183 mg/m3[1]，是迄今发现的唯一双向性内吸性杀虫剂[2]。2008年在美国、加拿大、奥地利、新西兰、摩洛哥、土耳其和突尼斯登记，2009年在巴西、南非、荷兰、墨西哥获得登记，2011年3月在中国登记[2]。螺虫乙酯作用机制是通过抑制昆虫体内乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）活性，从而干扰脂肪的生物合成。目前国内对螺虫乙酯的研究主要集中在合成工艺、开发[2-3]、药效及毒性效应等方面。研究显示，螺虫乙酯对介壳虫[4]、烟粉虱[5]和蚜虫[6]等刺吸式口器害虫有一定的防治效果。

研究发现螺虫乙酯能使非洲鲶鱼胚胎发育迟缓，并且干扰幼鱼的游动平衡以及对雌性斑马鱼有一定的毒性和氧化应激反应[7]。氧化应激反应可导致细胞凋亡，因此本文研究螺虫乙酯对斑马鱼的急性毒性以及细胞凋亡的影响，旨在探索螺虫乙酯对水生生物的毒性效应。文中细胞凋亡采用了DNA ladering 的方法，关于斑马鱼DNA提取方法的相关研究有刘臻等[8]利用试剂盒法和酚一氯仿法提取鲫鱼基因组DNA，并对比分析了2种方法的提取效果。S.Roques等[9]利用酚-氯仿法提取北大西洋深水雄鲑肌肉组织基因组DNA，并进行了遗传结构分析。目前，尚未见针对螺虫乙酯对斑马鱼细胞凋亡研究的相关研究报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试生物

野生AB型斑马鱼（AB-Line）由国家斑马鱼中心引进，为实验室条件封闭体系中自行繁殖的F2代。试验用幼鱼体长（2±1）㎝、体重（0.4±0.1）g的；驯养条件为水温（25±1）℃，光照与黑暗周期为14 h/10 h，每天早9：00，晚19：00各喂食1次，自然死亡率<1%。试验前24 h停止喂食，试验期间不喂食。在成鱼中挑选鱼鳍完整、体色光亮、行动活泼、逆水性强、大小无太大悬殊且无任何疾病的鱼作为试验用鱼。以免除了药物以外其他外在因素对试验造成影响。

1.1.2 稀释水

试验用水及水质条件：整个试验饲养用水为曝气24 h以上的去氯自来水，温度为（25±1）℃，pH为6.7～8.5。

1.1.3 供试药品

螺虫乙酯（含量98.12%，南京禾源化学有限公司）；吉姆萨（Giemsa）（北京索莱宝科技有限公司）、Tris饱和酚（北京索莱宝科技有限公司）；蛋白酶K（北京全式金生物技术有限公司，20 mg/mL）、DNA Loading Buffer（北京全式金生物技术有限公司）、DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）；丙酮（西陇化工有限公司）、吐温80（西陇化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 斑马鱼的急性毒性试验

斑马鱼急性实验参照《OECD， Guidelines for the testing of chemicals，Fish acute toxicity test》[10]进行。根据预实验的结果，正式实验设置螺虫乙酯的浓度梯度设置为2.5、2.97、3.54、4.20、5.00 mg/L（设置浓度方法如下：r=，r-相邻两组剂量的比值；b-最高致死量；a-最低致死量；n-设计的组数），并设曝气水作为空白对照和溶剂对照。每个容器中放入10尾斑马鱼。分别在24、48、72、96 h时检查受试斑马鱼的存活状况及行为。并记录斑马鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力减弱等），而且试验开始和结束时测定所用水的pH和温度，pH为6.7～8.5，温度为（26±1）℃。同时选取重铬酸钾（GR） 作为参比物，重铬酸钾浓度分别为100、150、225、338、506 mg/L，测定斑马鱼的敏感性24 h的LC50。

根据GB/T21281-2007 《危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法》中鱼类96 h急性毒性的分级标准[14]，进行毒性分级。

1.2.2 斑马鱼DNA提取

酚-氯仿法参照PaaboS[8]等方法。改进的酚-氯仿法：取平均体长（2±1）cm，平均体重（0.4±0.1）g的斑马鱼。试验前，斑马鱼样本在-80 ℃的超低温冷冻（1 h）。将斑马鱼分别放入300 μL组织提取液（Tris-C1 10 mmol/L，EDTA 0.1 mol/L，SDS 0.5%，pH=8.0）的1.5 mL离心管中，充分剪碎至匀浆状态，加入300 μL组织提取液、加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL）和 5 μL RNA酶（20 mg/mL），充分混匀，于55 ℃水浴锅消化至澄清。加入300 μL Tris饱和酚和300 μL氯仿抽提，充分混合10 min，13 000 r/min离心10 min，吸取上清加600 μL氯仿抽提，充分混合10 min，13 000 r/min离心10 min，转移上清至新离心管中，加1 000 μL无水乙醇沉淀DNA，5 000 r/min离心3 min，弃上清液，用70%乙醇洗2次，室温下干燥，最后加40 μL 无菌水溶解DNA，-20℃贮存备用。

吸取所提取的斑马鱼的基因组DNA 1 μL，以灭菌的去离子水为对照，在NanoDrop 2000蛋白核酸仪（上海创萌生物科技有限公司）上检测其浓度以及A260/A280的比值。

用0.8%的琼脂糖凝胶，电泳检测各浓度鱼的基因组DNA，电压130 V，室温下电泳30 min左右，用凝胶成像系统拍照保存，并对电泳结果进行分析，检测细胞凋亡情况。

1.2.3 微核实验

于染毒后96 h，随机选取各浓度及对照组的斑马鱼3条，滤纸拭去斑马鱼表面的水，用眼科剪刀剪尾，经过肝素钠湿润过10 μL移液枪枪头吸取外周血液，滴至洁净的载玻片上，推玻片以30°匀速推动血滴，形成均匀的血膜。每尾鱼制取2张片，晾干后用甲醇固定10 min左右。

将血涂片放置于染色架上，再用10%吉姆萨（Giemsa）溶液染色覆盖全部血膜，室温染色20 min。用蒸馏水从玻片的一头冲洗，晾干。

以30 μg/mL环磷酰胺溶液作阳性对照。使用显微镜OLYMPUS BX51 图像分析软件Image-Pro Plus 6.0观察并拍照。每张玻片统计3 000个细胞，并按下列公式计算微核细胞的千分率[13]。

微核率=观察到的微核细胞数/观察的细胞总数×1 000‰

1.2.4 数据处理

用SPSS Statics17.0和Excel 软件进行数据统计分析，求得螺虫乙酯对斑马鱼的细胞微核率及单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

重铬酸钾对斑马鱼24 h的LC50值为241 mg/L，满足参比物重铬酸钾24 h的LC50值在200～400 mg/L，满足OECD试验有效性要求。

螺虫乙酯对斑马鱼的毒性试验结果见表1。测得螺虫乙酯96 h的LC50值为3.642 mg/L，为中毒。

2.2 细胞凋亡检测

2.2.1 分光光度法检测

DNA质量的分光光度法检测纯净的DNA样品A260/A280的比值应为1.80，处于1.65～1.87，属于正常，若高于1.80，表明样品中可能含有RNA；若低于1.80，表明样品中可能含有蛋白质或苯酚。经试验检测，本试验A260/A280的比值在正常范畴内（表2）。

2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡

如若细胞出现凋亡现象，则会在琼脂糖凝胶电泳出现180～200 bp整数倍的DNA梯形带。由图1可见，螺虫乙酯处理组在琼脂糖凝胶电泳上出现180～200 bp整数倍的DNA梯形条带，空白对照和溶剂对照没有断代现象，随着螺虫乙酯浓度的提高，电泳图像尾部的梯形带现象逐渐明显。表明在较高浓度螺虫乙酯溶液中的斑马鱼出现细胞凋亡现象。

2.3 微核试验

阳性对照环磷酰胺的微核率为16.2‰，与空白对照相比差异较显著。螺虫乙酯处理组微核试验结果表明，浓度由低到高（2.50、2.97、3.54、4.20 mg/L）微核率依次升高。在p≤0.01水平各组之间均无显著差异，在p≤0.05各处理与对照（溶剂对照）差异达显著水平，其中2.50、2.97 mg/L两个浓度差异不显著，3.54、4.20 mg/L两个浓度差异较显著。见表3。

3 讨论

本试验测得的螺虫乙酯对斑马鱼幼鱼96 h的LC50值为3.642 mg/L，该结果与毛晨蕾等的螺虫乙酯对雌性斑鱼的毒性和应激反应中所得到的7.21 mg/L（96 h）[7]有所不同，但同属中毒范围，作者认为主要原因是本试验采用的是幼鱼，而毛晨蕾等的试验采用的是成鱼，幼鱼较成鱼对药剂更为敏感；可能还与本试验用鱼为AB型野生品系，遗传背景比较清楚，毛晨蕾等试验采用的是从浙江省杭州市花鸟市场上购买的雌性斑马鱼有关。

根据目前的研究，提取动物基因组DNA 的方法较多，但总的来说，最为关键的有3点：（1）破碎细胞壁和细胞膜使DNA和蛋白质释放到提取液中；（2）消除蛋白质，RNA 等杂质的污染；（3）防止DNA的消解，利用常温方法提取基因组DNA 的步骤较为繁琐复杂，使用的试剂较多，且提取的DNA 质量不高，含蛋白，RNA 等杂质[14]，本试验在传统的酚-氯仿提取方法的基础上进行了改进，直接将试样组织放入-80℃中冷冻1 h，使组织在低温下能充分破碎，加适量的提取液，保证提取液最大程度地破坏细胞壁，使白酶K和RNA酶达到最大的消化效率。采用55℃的恒温水浴锅温浴，直至离心管中澄清透明，在此期间，经常对离心管进行倒转混匀，以防止出现沉淀影响消化效率[15]且整个提取过程不需要低温离心，操作简单，提取的DNA质量明显高于传统常温的酚-氯仿法。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，它是细胞接收死亡信号产生的一种受其自身基因调控的主动自杀的生物学过程。DNA ladder方法观察，其特征表现为凝胶电泳呈现DNA梯状带。在Caspase家族半胱氨酸蛋白酶在凋亡中的关键作用发现以前，人们所认识到的细胞凋亡的最主要特征是DNA发生核小体间的断裂，结果产生含有不同数量核小体单位的片段，在进行琼脂糖凝胶电泳时，形成了特征性的梯状条带（DNA ladders）[15]其大小为180～200 bp的整数倍。目前，梯状条带仍然是鉴定细胞凋亡较可靠的方法[16]。使用改进后的酚-氯仿法，提取出斑马鱼基因组DNA纯度较高，方法简便易于操作，并且保证了试验数据的准确性。琼脂糖凝胶电泳成像中DNA条带清晰，完整，拖带不明显，且随着染毒螺虫乙酯浓度的逐渐增加，电泳图片逐渐出现梯状条带，分析是细胞凋亡现象。

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