炔雌醚对小鼠附睾与副性腺肥大细胞数量和分布的影响

李 健，陈耀星，陈福宁，王子旭，曹 静，董玉兰，陈树林

（1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003；2.中国农业大学动物医学院，北京100193；3.北京昌平区中西医结合医院，北京102208；4.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

肥大细胞（mast cells，MC）来源于造血干细胞，广泛分布于结缔组织、黏膜组织及血管周围，是一类广泛分布于全身组织和器官的非特异性免疫细胞，易接触病原体和变应原等物质从而参与过敏反应的病理过程［1－4］。自1878年发现MC以来，人们对MC在疾病中的作用进行了广泛而深入的研究。MC脱颗粒是机体的一种防御反应，也是速发型变态反应（I型超敏反应）和炎症等病理反应的基础。肥大细胞胞质颗粒内含有多种生物活性物质，如组织胺、5－羟色胺、蛋白多糖、中性蛋白酶、白三烯、前列腺素、血小板活化因子及多种白细胞介素（IL）等。肥大细胞受刺激时，以胞吐方式大量释放颗粒内的物质（常称为脱颗粒）［5－7］。肥大细胞通过脱颗粒释放胞浆中生物胺、蛋白多糖及中性蛋白酶等生物活性物质，参与多种抗病过程，如抗肿瘤发生、抗寄生虫感染等。MC在慢性炎症和纤 维化的发病机制中起重要作用［8－9］。肥大细胞存在于健康动物的睾丸中，在不育动物睾丸中数量增加，如在睾丸萎缩、精索静脉曲张造成的曲细精管硬化和纤维化疾病动物［10］。在生精异常的动物睾丸间质和曲细精管管周肥大细胞数量显著增加［11］。研究发现，肥大细胞可通过释放物如前列腺素、干扰素及肿瘤坏死因子等影响精子发生过程，降低精液品质及生育能力［12－13］。睾丸中有MC的分布，并在睾丸生精过程中发挥着重要的作用，随着睾丸内环境改变，MC数量和分布均发生改变［14－15］。本研究将探讨炔雌醚对成年小鼠附睾与副性腺MC的形态、数量、分布的影响，旨在揭示MC在雌激素样环境内分泌干扰诱发生精异常过程中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性小鼠18只，平均体重30g±2g，自由采食、饮水，在每天14h光照，10h黑暗的条件下进行饲喂。

1.1.2 改良的TB染液 8g／L甲苯胺蓝，6g／L高锰酸钾，蒸馏水煮沸配制而成。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 经7d适应后，炔雌醚处理。随机分为3组（每组6只），分别皮下注射50μL 含0、0.1、1mg／kg炔雌醚的橄榄油，每天1次，连续2周。动物处理过程中，每天称重；处理结束后，将小鼠麻醉，称重。取双侧附睾、精囊腺及前列腺，多聚甲醛固定，制作石蜡切片。

1.2.2 肥大细胞染色 附睾、精囊腺及前列腺切片常规脱蜡至蒸馏水后，入改良的TB染液（8g／L甲苯胺蓝，6g／L高锰酸钾，蒸馏水煮沸配制）中浸染约5 min，蒸馏水洗2次后，用5mL／L盐酸酒精分色（显微镜下控制），1 000mL／L酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，分别计数对照组与试验组附睾被膜和间质中肥大细胞的数量。

1.2.3 数据统计 以上数据用SPSS12软件包进行单因素方差分析（One Way ANOVA），数据以均值±标准差±SD）表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 对附睾肥大细胞数量和分布的影响

经炔雌醚处理后，成年雄性小鼠附睾的肥大细胞数量有增多趋势，但在不同的部位其增长幅度有所区别（图1）。在附睾头被膜，对照组每1mm2视野中肥大细胞数为40.32个，在0.1mg／kg、1mg／kg试验组分别增加到47.25个／mm2和59.38个／mm2，差异极显著（P＜0.01）；在附睾头间质，即附睾头附睾管管周，对照组肥大细胞数为36.25个，在0.1mg／kg和1mg／kg试验组分别增加到41.65个／mm2和49.45个／mm2，差异极显著（P＜0.01）；而在附睾尾被膜，对照组肥大细胞数为42.42 个／mm2，在0.1 mg／kg、1mg／kg试验组分别增加到51.82个／mm2（P＜0.05）和57.47个／mm2（P＜0.01）；在附睾尾间质，即附睾尾附睾管管周，对照组肥大细胞数为37.58个／mm2，在0.1mg／kg、1mg／kg试验组分别增加到44.43个／mm2（P＜0.05）和56.46个／mm2（P＜0.01）。

2.2 对精囊腺及前列腺肥大细胞数量和分布的影响

在精囊腺被膜，对照组每1mm2视野中肥大细胞数为45.55 个，0.1 mg／kg 剂 量 组 肥 大 细 胞 数 量（57.38个／mm2）变化不明显，在1mg／kg试验组分别增加到62.35个／mm2，差异极显著（P＜0.01）；在精囊腺间质，对照组肥大细胞数为44.60个／mm2，0.1 mg／kg肥 大 细 胞 数 量 无 明 显 变 化，1 mg／kg 组 每1mm2分别增加到61.38个，差异极显著（P＜0.01）。而在前列腺被膜，对照组肥大细胞数为52.73 个／mm2，在0.1 mg／kg、1 mg／kg试验组分别为56.52个／mm2（P＞0.05）、64.75个／mm2（P＜0.05）；在前列腺间质，对照组肥大细胞数为53.55个／mm2，1mg／kg组每1mm2分别增加到82.47个，差异极显著（P＜0.01），0.1 mg／kg组无明显变化（图2 和表2）。同时，炔雌醚高剂量组的精囊腺及前列腺管壁间间隙明显增大，结缔组织显著增生。

图1 不同剂量炔雌醚处理后成年小鼠附睾肥大细胞数量和分布的变化Fig.1 Changes of number and distribution of mast cells in epididymidis after treatment with quinestrol

图2 不同剂量炔雌醚处理后成年小鼠精囊腺、前列腺肥大细胞数量和分布的变化Fig.2 Changes of number and distribution of mast cells in seminal vesicle and prostate after treatment with quinestrol

表1 不同剂量炔雌醚对小鼠附睾肥大细胞数量的影响（细胞／mm2）Table 1 Effects of quinestrol on number of mast cells in epididymis in adult male mice

表2 不同剂量炔雌醚对小鼠精囊腺与前列腺肥大细胞数量的影响（细胞／mm2）Table 2 Effects of quinestrol on number of mast cells in seminal vesicle and prostate

3 讨论

近50年来世界男性的精液品质急剧下降，隐睾、睾丸肿瘤、尿道下裂、前列腺癌等生殖道疾病发生率快速增加［15－16］。环境内分泌干扰物及植物不育剂对雄性生殖功能损伤的研究大多集中在睾丸精子发生和精液品质等环节［17－18］。肥大细胞是一种重要的免疫细胞，也是结缔组织的基本细胞成分，广泛地分布于全身各部。胞质颗粒内含有多种生物活性物质，如组织胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子及多种白细胞介素（IL）等。肥大细胞受刺激时，以胞吐方式大量释放颗粒内的物质（常称为脱颗粒），在人类及动物的健康与疾病过程中发挥重要的作用。肥大细胞分泌的炎症介质（如类花生酸类物质、蛋白多糖、蛋白酶）和趋化因子能促进细胞凋亡［19］。生物化学研究表明肥大细胞的成分，如胰蛋白酶、前列腺素及干扰素等能抑制精子发生过程。此外，肥大细胞含有组织胺、血清素等，后者还能调节维持正常生精过程的重要激素－睾酮的合成［20］。本研究结果表明，炔雌醚处理后成年小鼠附睾、精囊腺、前列腺肥大细胞数量明显增加，并伴有精囊腺、前列腺腺体管壁间明显的结缔组织增生。石嵩山等发现新生鼠雌激素注射后曲精小管有明显萎缩，而且睾丸肥大细胞数量也显著增多［14］。Meineke V 等［21］研究 认 为，生 育 功 能 障 碍 者肥大细胞含有纤维蛋白溶酶，肥大细胞数量增多、分布改变，而且，肥大细胞能诱导睾丸间质增生。本研究发现炔雌醚处理后诱导成年小鼠附睾、精囊腺、前列腺也出现相似的形态变化，肥大细胞数量增多，常伴行于附睾管间质、被膜附近，说明肥大细胞不但对睾丸中生精细胞的发育有影响，可能对附睾中生精细胞的进一步发育成熟也有影响。因此，肥大细胞可能参与了炔雌醚影响正常生精功能的过程，它在附睾、精囊腺、前列腺中的数量和分布的改变表明其参与了附睾中精子进一步成熟的调节，是炔雌醚诱发成年小鼠生精异常和附睾精子数量减少的原因之一。

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