一种华法林用药指导的多重SNP检测方法

颜进 南丽

(宁波海尔施基因科技有限公司 浙江宁波 315800)

一种华法林用药指导的多重SNP检测方法

颜进 南丽

(宁波海尔施基因科技有限公司 浙江宁波 315800)

目的：为患者提供一种华法林用药指导的多重SNP检测方案。方法：采用多重PCR和毛细管电泳片段分离技术，同步检测人基因组DNA 的5个SNP位点的7个基因型。结果：14个基因型、3个人基因组DNA内参及1个PCR反应内参可以在同一个反应管中扩增，在毛细电泳时清晰分离。

华法林;SNP;个体化用药

华法林是香豆素类口服抗凝血药，在体内有对抗维生素K(Vk)的作用，可以抑制维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的在肝脏的合成，对血液中已有的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ并无抵抗作用。目前被广泛应用于血栓栓塞性疾病的抗凝治疗，但因治疗窗窄，疗效和不良反应个体差异很大，不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。据估计，服用华法林的患者中，每年有15.2%的人发生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5%。研究发现，药酶CYP2C9*2和*31、维生素K环氧化物还原酶复合体第1亚单位(VKORC1)的G-1639A［1］和C1173T［2］基因型、药酶CYP4F2*3［3］、钙控蛋白基因(CALU)rs339097［4］及γ-谷氨酰基羧化酶基因(GGCX)rs11676382［5］与华法林疗效密切相关。华法林主要经由CYP2C9代谢，CYP2C9*2和*3基因突变导致酶活性降低从而使华法林代谢减慢，血液中华法林浓度过高，易出现出血等严重不良反应。华法林抑制VKORC1，从而发挥抗凝血作用，VKORC1的基因突变可使体内VKORC1的生成减少，进而对华法林的需求量下降，血液中华法林浓度相应升高，需要减少。CYP4F2是维生素K的氧化酶，突变减少了Vk的代谢，使Vk浓度升高，需要提高华法林剂量。CALU可调控VKORC1，突变患者需要增加华法林剂量。GGCX利用被VKORC1还原的Vk激活凝血因子，突变患者需要减少华法林剂量。

本研究开发了一种用于华法林用药指导的多重基因检测试剂盒，同步检测与华法林用药相关的5个基因7个SNP位点的等位基因型，为医生和患者提供了一种华法林用药指导的新型检测方案。

1.材料和方法

DNA提取

以抗凝静脉血作为样本进行DNA提取。DNA提取在自动化提取工作站Smart LabAssist-32(台湾圆点奈米技术有限公司)上完成。试剂盒使用"核酸自动提取试剂盒(磁珠法)"(宁波海尔施基因科技，货号：1060055)。

PCR扩增

PCR扩增反应：华法林PCR预混液16μL、Taq DNA聚合酶2μL、样品DNA/华法林阳性对照2μL。混匀后按以下温度进行热循环反应：94℃3分钟;94℃30秒，60℃30秒，70℃30秒，共35个循环;72℃3分钟;4℃保存产物。

DNA片段分离

采用遗传分析仪(3500/3130，美国生命公司或GeXP，美国贝克曼库尔特公司)进行DNA片段分离，详见说明书。

2.结果

华法林试剂盒检测人DNA样品，因每个SNP位点有可能出现2个基因型峰，故共可能出现11-18个特征峰，其中7-14个为SNP特征峰、3个人DNA内参特征峰(B1-B3)和1个PCR反应内参pcDNA特征峰(图1)。华法林阳性对照检测结果应出现全部18个特征峰。

图1 本试剂盒检测人DNA样品结果举例。共出现12个特征峰：7个SNP位点只有1个杂合子(CYP4F2)，即8个基因型峰和4个内参峰。

3.讨论

目前常用的SNP检测方法：qPCR法的优点是灵敏度高、准确性强，其缺点是通量低且探针成本高;DNA芯片有高通量等优点，其缺点为成本昂贵、灵敏度低、重复性差且准确性低;Sanger测序法是SNP分析金标准，能发现已知SNP和未知SNP，缺点是工作量大，周期长，多位点检测累计价格相对昂贵。

本研究提供了一种快速、准确同步检测多个SNP位点用于指导华法林用药指导的新方法。目前，国内外尚无类似的研究报道。

［1］Santos PC，et al.CYP2C9 and VKORC1 polymorphisms influence warfarin dose variability in patients on long-term anticoagulation.Eur J Clin Pharmacol.2013 Apr;69(4)：789-97.

［2］Carlquist JF，et al.Genotypes of the cytochrome p450 isoform，CYP2C9，and the vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 conjointly determine stable warfarin dose：a prospective study.J Thromb Thrombolysis.2006 Dec;22(3)：191-7.

［3］Hamberg AK，et al.Characterizing variability in warfarin dose requirements in children using modelling and simulation.Br J Clin Pharmacol.2014 Jul;78(1)：158-69.

［4］Voora D，et al.A polymorphism in the VKORC1 regulator calumenin predicts higher warfarin dose requirements in African Americans.Clin Pharmacol Ther.2010 Apr;87(4)：445-51.

［5］King CR，et al.Gamma-glutamyl carboxylase and its influence on warfarin dose.Thromb Haemost.2010 Oct;104(4)：750-4.

R452

B

1009-6019(2015)03-0060-02

卓永，(1963-11-)，男，大专，江苏睢宁，主治医师