猴耳环化学成分的分离与鉴定

陈昱桦

(天津医科大学总医院，天津 300012)



猴耳环化学成分的分离与鉴定

陈昱桦

(天津医科大学总医院，天津 300012)

目的：对猴耳环嫩枝及叶70%乙醇-水提取物的化学成分进行分离鉴定。方法：利用多种色谱法对提取物进行分离，通过理化性质、波谱数据分析等方法，鉴定了化合物的结构。结果：从猴耳环嫩枝及叶70%的醇提物中分离到8个已知单体化合物(Ⅰ～Ⅷ)，光谱法鉴定结构分别为(+)-儿茶素(Ⅰ)、(-)-(2S)-5,7,3′,4′,5′-五羟基黄烷(Ⅱ)、(-)-(2R)-5,7,3′,4′,5′-五羟基黄烷-7-没食子酸酯(Ⅲ)、(-)-(2R,3R)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(Ⅳ)、3-(4′-羟基-3′,5′-二甲氧基)-苯基-1,2-二丙醇(Ⅴ)、3-(4′-羟基-3′-甲氧基)-苯基-1,2-二丙醇(Ⅵ)、绿原酸乙酯(Ⅶ)、4-O-β-D-吡喃葡萄糖基反式肉桂酸(Ⅷ)。结论：化合物Ⅴ～Ⅷ为首次从该属植物中分离得到。

猴耳环，化学成分，结构鉴定

猴耳环(PithecellobiumclypeariaBenth)为豆科含羞草亚科猴耳环属植物，又名落地三钱、蛟龙木、鸡三树、围诞树，主要分布于我国华南、西南等地[1]。其叶、果实、种子均可入药，功能清热解毒、凉血消肿、止泻[2]，民间外用于烧伤、烫伤、疮痈疖肿的治疗[3]。现代临床其主要用于治疗上呼吸道感染、急性胃肠炎、急性咽喉炎、急性扁桃体炎，并有明显的抗流感病毒作用[4-7]。目前，国内外已有学者从该属植物中分离得到黄酮类、三萜和甾体类、挥发油类、酚酸类等多种化学成分。但总体来说，对于猴耳环化学成分的研究水平还相对较低，为进一步研究猴耳环的化学成分，作者应用现代分离技术，从其70%乙醇提取物中分离纯化得到了8个化合物，经用现代波谱分析等方法鉴定了各化合物的结构，其中，化合物Ⅴ～Ⅷ为首次从该属植物中分离得到。

1 材料和方法

1.1 实验仪器 核磁共振波谱仪 (Bruker ARX 400 NMR spectrometer, TMS 作为内标)；ESI-MS (Brukermicromass Q-Tof mass spectrometer)；高效液相色谱仪 (HITACHI，检测器655 variable wavelenth UV Monitor；Waters，检测器2489 UV/Visible Detector)；分析色谱柱 (YMC ODS-A， 150 mm×4.6 mm，5 μm)；制备色谱柱 (YMC ODS-A, 250 mm×10 mm，5 μm)；CD光谱仪 (Bio-Logic MOS 450)。

1.2 实验材料 猴耳环药材(产自广西，经鉴定为猴耳环的嫩枝和叶)。薄层色谱硅胶H、GF254(青岛海洋化工厂)；柱色谱硅胶(100～200目，200～300目，青岛海洋化工厂)；ODS柱色谱填料 (60～80 μm, 德国Merck)；Sephadex LH-20 (北京绿百草)；D101大孔吸附树脂 (天津大学化工厂)；常规用试剂均为AR级。

1.3 实验方法 取猴耳环干燥枝叶8 kg，经体积分数为70%乙醇溶液加热回流提取3次，合并提取液并减压回收溶剂，得浸膏350 g，浸膏用水混悬后，经D101大孔吸附树脂分别以水和体积分数30%、60%、90%乙醇水溶液洗脱。取体积分数为60%乙醇洗脱物经过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、ODS柱色谱洗脱，再经反相半制备型高效液相色谱仪纯化。

2 结果

共分离得到化合物Ⅰ19 mg，Ⅱ 66 mg，Ⅲ 29 mg，Ⅳ 38 mg，Ⅴ 5 mg，Ⅵ 19 mg，Ⅶ 3 mg和Ⅷ 36 mg。分子结构式见图1。

图1 化合物Ⅰ-Ⅷ的分子结构式

2.1 化合物Ⅰ 白色无定形粉末(甲醇)，10%硫酸-香草醛喷雾烘烤显紫色。1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6) 谱中：δ 6.60 (1H, dd,J=8.0 Hz, 1.6 Hz), δ 6.70(1H, d,J=8.0 Hz), δ 6.73 (1H, d,J=1.6 Hz)为一个典型的ABX偶合系统中的三个芳基质子信号，δ 5.64 (1H, d,J=2.0 Hz), δ 5.85 (1H, d,J=2.0 Hz) 为间位偶合的两个芳基质子信号，δ 4.43 (1H, d,J=7.5 Hz), δ 3.79 (1H, m) 为两个次甲基的质子信号，δ 2.36 (1H, dd,J=16.0, 8.0 Hz), δ 2.68 (1H, dd,J=16.0, 5.3 Hz) 为亚甲基碳上的两个偕偶质子信号。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 谱中显示有15个碳信号，数据如下：81.6(C-2)，66.7(C-3)，28.3(C-4)，155.6(C-5)，95.8(C-6)，156.5(C-7)，94.3(C-8)，156.2(C-9)，99.4(C-10)，131.2(C-1′)，115.0(C-2′)，145.1(C-3′)，145.1(C-4′)，115.4(C-5′)，118.7(C-6′)。以上数据和文献[8]中化合物儿茶素的数据基本一致，故鉴定其平面结构为儿茶素。由偶合常数J2,3= 7.5 Hz可知其相对构型为H-2/H-3反式[9]，在CD谱中，化合物Ⅰ在240 nm处呈现正的Cotton效应，280 nm处呈现负的Cotton效应，确定该化合的绝对构型为 (2R,3S)[10]，最终化合物Ⅰ的结构鉴定为 (+)-儿茶素。

2.2 化合物Ⅱ 白色无定形粉末 (甲醇)，10%硫酸-香草醛喷雾烘烤显紫色。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)谱中，δ 5.67 (1H, d,J=1.9 Hz), δ 5.86 (1H, d,J=1.9 Hz)，δ 6.28 (2H, s)为四个芳香质子信号，δ 2.46 (2H, m), δ 1.98 (1H, m), δ 1.76 (1H, m) 为一组亚甲基质子信号。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 谱中显示有15个碳信号，其数据如下：77.3(C-2)，19.5(C-3)，29.8(C-4)，156.6(C-5)，95.6(C-6)，156.8(C-7)，94.6(C-8)，156.4(C-9)，100.6(C-10)，132.6(C-1′)，105.3(C-2′)，146.1(C-3′)，132.2(C-4′)，146.1(C-5′)，105.3(C-6′)。化合物Ⅱ的核磁数据与文献[11]中的化合物特利黄烷的数据基本一致，故鉴定化合物Ⅱ为特利黄烷。在CD谱中，化合物Ⅱ在280 nm处呈现负的Cotton效应，确定其绝对构型为2S[10]，最终化合物Ⅱ的结构鉴定为(-)-(2S)-5,7,3′,4′,5′-五羟基黄烷。

2.3 化合物Ⅲ 黄色油状物(甲醇)，10%硫酸-香草醛喷雾烘烤显紫色。ESI-MS给出[M+Na]+峰m/z465.1，可知化合物Ⅲ的分子量为442，结合碳谱和氢谱数据推测该化合物的分子式为C22H18O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) 谱中：δ 6.35(2H, s) 为苯环上对称的的两个质子信号，δ 6.17 (1H, d,J=2.0 Hz), δ 6.13 (1H, d,J=2.0 Hz)为苯环上一组间位偶合的质子信号，δ 4.76 (1H, d,J=10.1 Hz), δ 2.62 (2H, m), δ 2.06 (1H, m), δ 1.88 (1H, m) 可能为黄烷C环质子信号，提示该化合物的结构中可能存在一个黄烷母核。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 谱中显示有22个碳信号，其信号数据如下：77.3(C-2)，29.1(C-3)，19.5(C-4)，156.6(C-5)，100.9(C-6)，150.3(C-7)，101.5(C-8)，156.7(C-9)，107.4(C-10)，133.2(C-1′)，105.7(C-2′)，146.6(C-3′)，132.1(C-4′)，146.6(C-5′)，105.7(C-6′)，118.9(C-1′′)，109.6(C-2′′)，146.3(C-3′′)，139.7(C-4′′)，146.3(C-5′′)，109.6(C-6′′)，164.8(C-7′′)。经与文献对比，化合物Ⅲ的核磁数据与文献[12]中报道的 (-)-5,3′,4′,5′-五羟基黄烷-7-没食子酸的数据基本一致，因此平面结构得以确定。在CD谱中，该化合物在280 nm处呈现正的Cotton效应，从而确定其绝对构型为2R[10]，最终化合物Ⅲ的结构鉴定为(-)-(2R)-5,7,3′,4′,5′-五羟基黄烷-7-没食子酸酯。

2.4 化合物Ⅳ 白色无定形粉末(甲醇)，10%硫酸-香草醛喷雾烘烤显紫色。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)谱中，δ 5.96 (1H, s), δ 5.84 (1H, s) 为黄烷A环的两个质子信号，δ 6.27 (2H, s) 为黄烷B环的两个对称质子信号，δ 2.58 (1H, m), δ 2.55 (1H, m) 为亚甲基上的偕偶质子信号，δ 5.24 (1H, d,J=4.8 Hz) 和δ 5.04 (1H, d,J=4.8 Hz) 为两个连氧次甲基的质子信号，从1H-NMR可以推测该化合物的结构中可能存在一个黄烷-3-醇的骨架结构。在13C-NMR (400 MHz, DMSO-d6) 谱给出22个碳信号，其数据如下：77.6(C-2)，69.6(C-3)，22.9(C-4)，157.5(C-5)，95.6(C-6)，156.8(C-7)，94.5(C-8)，155.1(C-9)，97.8(C-10)，129.3(C-1′)，105.6(C-2′)，146.6(C-3′)，133.2(C-4′)，146.6(C-5′)，105.6(C-6′)，119.6(C-1′′)，109.1(C-2′′)，146.2(C-3′′)，139.2(C-4′′)146.2(C-5′′)，109.1(C-6′′)，165.7(C-7′′)。由氢谱δ 7.05 (2H, s)的信号和碳谱上δ 109.1, 119.6, 139.1, 146.0, 165.7的信号推测结构中存在一个没食子酰基片段。将化合物Ⅳ与化合物Ⅰ的碳谱数据进行比较，化合物Ⅳ中C-3的化学位移值向低场位移了2.9 ppm, C-2和C-4位分别向高场位移了4.0 ppm和5.4 ppm, 确定没食子酰基与黄烷-3-醇的C-3成酯。化合物Ⅳ的氢谱和碳谱数据与文献[13]中已知化合物 (-)-没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯的核磁数据基本一致。由偶合常数J2,3=4.8 Hz可知其相对构型为H-2/H-3顺式[9]，在CD谱中，化合物Ⅳ在240 nm处呈现负的Cotton效应，280 nm处呈现负的Cotton效应，结合化合物Ⅰ的绝对构型为(2R,3R)[10]，最终化合物Ⅳ的结构鉴定为 (-)-(2R,3R)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯。

2.5 化合物Ⅴ 无定形粉末(甲醇)，ESI-MS(m/z)：[M+Na]+：251.1，结合1H-NMR、13C-NMR 谱确定其分子式为C11H16O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 6.47 (2H,s)为苯环上质子信号，δ 3.73 (6H,s)为两组甲氧基上质子信号，δ 3.65 (1H, m) 为连氧的次甲基质子信号，δ 3.30 (2H,d,J=5.2 Hz) 为连氧的亚甲基质子信号，δ 2.67 (1H, dd,J=13.6 Hz, 4.4 Hz), δ 2.43 (1H, dd,J=13.6 Hz, 7.6 Hz) 为同一碳上的两个偕偶质子信号，且该碳原子与另一手性碳原子相连。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 数据如下：δ 65.3(C-1)，72.6(C-2)，40.1(C-3)，129.6(C-1′)，106.8(C-2′)，147.6(C-3′)，133.5(C-4′)，147.6(C-5′)，106.8(C-6′)，56.1(OMe)，该化合物的波谱数据与文献报道数据[14]基本一致，故确定化合物为3-(4′-羟基-3′,5′-二甲氧基)-苯基-1,2-二丙醇。

2.6 化合物Ⅵ 黄色油状物(甲醇)，ESI-MS(m/z)：[M+Na]+：221.1，结合碳谱和氢谱确定其分子式为C10H14O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 6.76 (1H,s)，δ 6.68 (1H, d,J=8.0 Hz)，δ 6.62 (1H, d,J=8.0 Hz) 为苯环上一组ABX偶合的质子信号，δ 3.73 (3H,s)为甲氧基质子信号，δ 3.63 (1H, m) 为连氧的次甲基质子信号，δ 3.32 (2H,d,J=5.2 Hz) 为连氧的亚甲基质子信号，δ 2.65 (1H, dd,J=13.6 Hz, 4.8 Hz), δ 2.46 (1H, dd,J=13.6 Hz, 7.2 Hz) 为同一碳上的两偕偶质子信号，且该碳原子与另一手性碳原子相连。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 数据如下：δ 65.5(C-1)，73.2(C-2)，39.8(C-3)，130.8(C-1′)，113.9(C-2′)，147.5(C-3′)，144.9(C-4′)，115.3(C-5′)，121.7(C-6′)，55.3(OMe)。该化合物的核磁数据与文献报道数据[15]基本一致，故确定化合物结构为3-(4′-羟基-3′-甲氧基)-苯基-1,2-二丙醇。

2.7 化合物Ⅶ 棕色油状物(甲醇)，ESI-MS(m/z)：[M+H]+：383.1，结合碳谱和氢谱确定其分子式为C18H22O9。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 7.04 (1H，s)，δ 6.97 (1H, d,J=8.4 Hz)，δ 6.76(1H, d,J=8.0 Hz)为苯环上一组ABX偶合的质子信号，δ 7.40 (1H, d,J=16.0 Hz)，δ 6.15 (1H, d,J=16.0 Hz)为双键氢信号，根据双键偶合常数为16.0 Hz，判断为连苯环反式双键，δ 3.98 (4H, m)，δ 1.14 (3H, t,J=7.2 Hz)，虽然连氧碳上氢信号间有重叠，但是能看出有-OCH2CH3片段，还有两个连氧次甲基信号，δ 2.11(2H, m)，δ 1.93(1H, m)，δ 1.78 (1H, m)为亚甲基和次甲基质子信号，由于信号间有重叠，不能判定此片段。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)：δ 173.2, 165.7为酯基碳信号，δ 145.8, 145.3为苯环上的连氧碳信号，δ 125.3, 121.5, 116.1,113.8为苯环上的其余碳信号，δ 148.9,121.5为双键上碳信号，δ 73.2, 71.2, 69.7, 67.3, 60.5为连氧碳信号，其数据归属如下:73.2(C-1)，37.3(C-2)，71.2(C-3)，67.3(C-4)，69.7(C-5)，35.3(C-6)，173.2(C-7)，60.5(C-8)，13.9(C-9)，125.3(C-1′)，116.1(C-2′)，114.7(C-3′)，145.8(C-4′)，145.3(C-5′)，113.8(C-6′)，148.9(C-7′)，121.5(C-8′)，165.7(C-9′)。该化合物的碳氢谱数据与文献[16]报道基本一致，故确定化合物为绿原酸乙酯。

2.8 化合物Ⅷ 黄色油状物(甲醇)，ESI-MS(m/z)：[M+Na]+：349.1, 结合碳谱和氢谱确定其分子式为C15H18O8。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ7.63 (2H,d,J=8.8 Hz)，δ 7.05 (2H,d,J=8.8 Hz)提示为对位取代的苯环氢信号，δ 7.57 (1H, d,J=16.0 Hz), δ 6.40 (1H, d,J=16.0 Hz)为双键氢信号，根据双键耦合常数为16 Hz，判断为连苯环反式双键，δ 4.95 (1H, d,J=7.2 Hz)为糖端基氢信号，而且根据偶合常数为7.2 Hz，确定其为一个β构型的糖。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 60.8, 69.8, 73.5, 76.8, 77.4, 100.2为β-D葡萄糖碳数据，δ 159.1, 130.1, 128.3, 116.6为苯环上的碳信号，δ 143.8, 117.3 为双键上碳信号，δ 168.1 为酯基碳信号，其信号归属如下：159.1(C-1)，116.6(C-2)，130.1(C-3)，128.3(C-4)，130.1(C-5)，116.6(C-6)，143.8(C-7)，117.3(C-8)，168.1(C-9)，100.2(C-1′)，73.5(C-2′)，76.8(C-3′)，69.8(C-4′)，77.4(C-5′)，60.8(C-6′)。该化合物的碳氢谱数据与文献[17]报道基本一致，故确定化合物为4-O-β-D-吡喃葡萄糖基反式桂皮酸。

3 讨论

本实验在前人工作的基础上，利用大孔吸附树脂柱色谱、MCI柱色谱、聚酰胺柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、开放ODS柱色谱、硅胶柱色谱及制备HPLC等手段，从猴耳环提取物中分离得到8个化合物。通过理化性质及波谱数据(1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS、CD)进行了结构鉴定。其中化合物Ⅴ～Ⅷ为首次从该属中分离得到。目前，猴耳环化学成分的研究仍较少，通过本实验的研究，为进一步挖掘猴耳环的药效作用物质基础提供了一定的理论依据。

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Isolation and identification of chemical constituents fromPithecellobiumClypeariaBemth

Chen Yuhua

(Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300012)

Objective: To study the chemical constituents of the extracts with 70% ethanol - water from the twigs and leaves ofPithecellobiumClypeariaBemth. Methods:The compounds were isolated with macroporous resin, polyamide, ODS, Sephadex LH-20, HPLC, etc.their structures were identified by means of spectral data and literature. Results: The chemical structures of 8 compounds were elucidated as(+)-catechin(I), (-)-(2S)-5,7,3′,4′,5′-pentahydroxyflavan(II), (-)-(2R)-5,7,3′,4′,5′-pentahydroxyflavan(III), (-)-(2R,3R)-epigallocatechin-3-O-gallate(IV),3-(4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyphenyl)-propane-1,2-diol(V),3-(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-propane-1,2-diol(VI),chlorogenic acid ethyl ester(VII), 4-O-β-D-Glucopyranosyl-trans-p-coumaric acid(VIII). Conclusion:Compounds V ～ VIII were isolated from this genus for the first time.

PithecellobiumClypeariaBemth,chemical constituents, structure identification

2015-08-06

R284

A

1006-5687(2015)06-0005-04