内向整流钾通道阻断剂对内皮祖细胞功能的影响*

李文凭， 崔晓栋， 侯宁宁， 张晓芸， 刘建华， 张 静， 成 敏

(潍坊医学院潍医附院内分泌科， 山东 潍坊 261053)



内向整流钾通道阻断剂对内皮祖细胞功能的影响*

李文凭， 崔晓栋， 侯宁宁， 张晓芸， 刘建华， 张 静， 成 敏△

(潍坊医学院潍医附院内分泌科， 山东 潍坊 261053)

目的：研究内向整流钾通道阻断剂氯化钡(BaCl2)和氯化铯(CsCl)对内皮祖细胞(EPCs)功能的影响。方法：利用密度梯度离心法体外分离大鼠骨髓单核细胞，并进行体外诱导培养。待细胞培养至3～5代时将细胞消化并等密度接种于六孔板中，待细胞融合至80%时用含2%胎牛血清的M199对其进行同步化处理，然后分组进行干预。本实验主要分两组：①BaCl2(100 μmol/L)及其无BaCl2的台氏液组；②CsCl (1 mmol/L) 及其正常对照组。依照上述分组加入阻断剂干预12 h后，检测迁移、粘附功能及基质细胞衍生因子(SDF-1)、前列环素(PGI2)基因表达的变化。此外，收集各组处理3 d后的细胞上清，用ELISA试剂盒检测上清中SDF-1的含量。并进一步通过信号通路阻断剂预先干预内皮祖细胞(EPCs)，然后重复上述处理，并用荧光定量RT-PCR检测SDF-1基因表达的变化来推测其作用机制。结果：与对照组相比，用BaCl2、CsCl处理后的EPCs迁移、粘附能力显著增强，SDF-1、PGI2基因表达量增加；ELISA检测结果显示，SDF-1分泌量较对照组明显增加。Ba2+、Cs+促进SDF-1分泌与eNOS信号通路有关；促进PGI2的分泌与P38信号通路相关。结论：Ba2+、Cs+具有促进EPCs迁移、粘附和分泌功能；SDF-1分泌增加的机制可能是通过eNOS信号通路来完成的，而PGI2与P38信号通路有关联。

内皮祖细胞；内向整流钾通道；功能；分泌；大鼠

内皮始祖细胞(endothelial progenitor cells ，EPCs)是存在于骨髓和外周血中的一种未完全分化的多功能干细胞，具有分化为多种血管内皮细胞的

潜能，并在促进血管发生和疾病后血管损伤修复方面扮演着十分重要的角色[1]。研究表明，改善EPCs的功能对于修复心血管疾病过程中的血管损伤具有重要的意义[2]。而且有报道称EPCs维持血管的完整性不仅仅通过分化为成熟的内皮细胞，更多的是通过分泌一些酶、生长因子和细胞因子等来发挥作用[3]。因此改变EPCs分泌等方面的功能对于血管性疾病来说具有关键性的作用。

Ba2+、Cs+是内向整流钾通道特异性通道阻断剂，在一定程度上可影响内向整流钾通道的电流及其所在细胞的功能，并参与了广泛的病理和生理过程。现有研究证实，内向整流钾通道表达于EPCs膜表面，并可以被Ba2+、Cs+阻断使得成血管数量减少，增值能力增强[4]。但是关于Ba2+、Cs+对EPCs分泌等方面的研究还不是很全面。故本实验通过利用钾通道特异性的阻断剂(Ba2+、Cs+)对EPCs的影响，不仅研究了其对EPCs功能的影响，并且着重讨论了对基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derived factor-1, SDF-1)、前列环素(epoprostenol, PGI2)等分泌因子的影响及其作用机制。因此本实验为钾通道阻断剂的实验室研究和临床应用提供更多的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

SD大鼠(由解放军第89医院实验中心提供)；EGM-2完全培养基(Lonnza，美国)；M199、胎牛血清和胰蛋白酶(Hyclone, 美国)；荧光定量相关试剂及基因相关引物(大连宝生物公司)；Trizol试剂(Invitrogen)；通道阻断剂；PBS缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；BaCl2、CsCl等化学试剂(天津科密欧化学试剂有限公司)；Boyden小室(江苏海门麒麟医用仪器厂)；SDF-1 ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad IQ5 )；倒置荧光显微镜(Leica, 德国)；酶标仪(Gene company limited, NO.20043, 美国)。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分离与培养 通过本实验组先前的方法[5]，诱导培养大鼠骨髓源性EPCs，步骤如下：颈椎脱臼法处死SD大鼠，将其浸泡在75%的乙醇中，15 min后取四肢长骨，反复吹打获取骨髓细胞。采用密度梯度离心法提取骨髓内单个核细胞，用EGM-2完全培养基诱导培养，本实验采用FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL双染色和流式细胞仪的方法鉴定EPCs ，双染色阳性及内皮细胞标志物(vWF,CD31,VEGFR2)在80%以上的EPCs，为本实验所采用细胞。

1.2.2 实验分组 待EPCs传至3～5代时按2×105cells/ml的密度接种于六孔板，在细胞融合至90%左右时用含2%胎牛血清的M199进行同步化12 h后，分组并设定对照组：(1)BaCl2组(无BaCl2台式液对照组)；(2)CsCl组(无CsCl对照组)。其中BaCl2浓度为100 μmol/L、CsCl浓度为1 mmol/L。实验所用的台氏液组成成分包括：NaCl(140 mmol/L)、HEPES(15 mmol/L)、NaHCO3(35 mmol/L、Glucose(6 mmol/L)，将pH调至7.4。

1.2.3 细胞粘附功能实验 用0.25%胰蛋白酶消化细胞并计数，按2×104cells/ml的密度接种于12孔板，每组设3个复孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱孵育30 min。取出后用PBS清洗三遍，放于倒置显微镜下观察，每孔随机取5个视野计数粘附细胞。

1.2.4 细胞迁移功能实验 用胰蛋白酶(0.25%)消化收集已处理过的EPCs并计数，Boyden小室的下室注满培养液，中间放置直径8 μm的滤膜，最后取相同密度细胞悬液100 μl置于上室，连接好后放于37℃，5%CO2细胞培养箱中，12 h后取下滤膜并用棉签擦拭未滤过的细胞，经DAPI染色后放于荧光显微镜下拍照。

1.2.5 荧光定量RT-PCR检测SDF-1、PGI2EPCs被干预12 h后，按说明书提取总RNA，并溶于20 μl经DEPC处理的去离子水中，取1 μl稀释溶解测定RNA浓度，经统一浓度后进行逆转录得cDNA。SYBR Green荧光定量RT-PCR测定各组SDF-1、PGI2的Ct值。根据Ct值，依照公式2 -Ct计算相对表达量。本实验的内参是GAPDH。实验所用引物由大连宝生物有限公司设计合成。

Tab. 1 Real-Time PCR primers

1.2.6 ELISA试剂盒检测SDF-1 当EPCs融合至80%时用胰蛋白酶消化细胞并接种于六孔板中，放在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，当细胞长满到70%时用2%M199同步化12 h，然后分组处理3 d，收集细胞上清。3 000 r/min的速度对细胞上清进行离心处理20 min。依照SDF-1 ELISA试剂盒的说明书进行过检测，并上机检测其OD值。

1.3 统计学分析

本次实验结果至少重复3次。用统计学分析软件SPSS 10.0进行统计学处理。在多组之间采用单因素方差分析，两组之间使用t检验。

2 结果

2.1 钾通道阻断剂对EPCs迁移、粘附功能的影响

经Ba2+、Cs+处理后的EPCs，贴壁能力明显增强，贴壁细胞数明显高于各自对照组(57.57±7.16)vs(36.00±7.19)、(53.71±6.49)vs(45.29±5.91)(图1)；细胞迁移数量也明显多于各自对照组(97.80±11.41)vs(52.60±9.21)、(71.40±19.37)vs(35.40±10.52)，(P<0.05，图2)。

Fig. 1 Effects of Ba2+and Cs+on the adhesion of EPCs EPCs: Endothe lial progenitor cells*P<0.05vscontrol

Fig. 2 Effects of Ba2+and Cs+on the migration of EPCs EPCs: Endothe lial progenitor cells*P<0.05vscontrol

2.2 钾通道阻断剂对SDF-1、PGI2基因表达的影响

经过Ba2+、Cs+处理后的EPCs，SDF-1的基因表达量分别是对照组的(1.92±0.52)、(3.89±1.03)倍；PGI2的基因表达量分别是对照组的(2.55±0.08)、(7.29±1.09)倍(P<0.05，P<0.01，图3)。

Fig. 3 Effects of Ba2+and Cs+on the gene expression of SDF-1and PGI2in EPCs s A: Group of Ba2+intervention; B: Group of Cs+intervention; SDF-1: Stromal cell-derived factor-1; PGI2: Epoprotenol; EPCs: Endothelial progenitor cells*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 ELISA试剂盒检测细胞上清中SDF-1含量结果

将收集的细胞上清用ELISA试剂盒检测的实验结果显示，Ba2+、Cs+干预后的EPCs上清中SDF-1含量较各自对照组显著增多(1.23±0.07)vs(1.12±0.01)、(1.89±0.08)vs(1.09±0.08)(P<0.05，图4)。

2.4 SDF-1、PGI2分泌增加的信号通路机制

预先加入信号通道阻断剂干预2 h后，再用Ba2+、Cs+处理12 h，实验结果显示，eNOS合成阻断剂L-NAME干预后，SDF-1分泌量较对照组降低(0.84±0.17、0.70±0.18)倍；P38阻断剂 SB203580处理EPCs后，PGI2分泌较对照组下降(0.44±0.08、0.52±0.07)倍。由此可推测，BaCl2和CsCl促进SDF-1分泌的作用可能是通过eNOs信号通道来完成的；PGI2分泌增加主要与P38途径相关(图5)。

Fig. 4 Effects of Ba2+and Cs+on the release of SDF-1 from EPCs. EPCs was treated with Ba2+(100 μmol/L) or Cs+(1 mmol/L) for 72 h SDF-1: Stromal cell-derived factor-1; PGI2: Epoprotenol; EPCs: Endothe lial progenitor cells*P<0.05vscontrol

Fig. 5 Effects of L-NAME and SB203580 on the gene expression of SDF-1 and PGI2in EPCs treated with Ba2+or Cs+A,C: Group of Ba2+intervention; B,D: Group of Cs+intervention; SDF-1: Stromal cell-derived factor-1; PGI2: Epoprotenol; EPCs: Endothe lial progenitor cells*P<0.05vscontrol

3 讨论

离子通道在人体内参与调节许多生理活动，是维持组织细胞正常生理功能的重要成员之一。离子通道在细胞、组织和器官中表达的改变不仅可以引起一些疾病的发生和发展，同时通过这种改变也可以达到治疗疾病的目的。内向整流钾通道作为离子通道中最具特异性的离子通道之一，其参与完成了多个生理功能：包括维持膜电位的稳定、促进胃酸分泌、参与视网膜的修复等[6]。本实验主要通过Ba2+、Cs+阻断EPCs内向整流钾通道的方法来研究EPCs分泌及多种功能的影响。

通过改善EPCs的功能为靶点来治疗疾病已成为最近几年研究的热点。已有相关文献证实，雌激素、促红细胞生成素、他汀类药物及体育锻炼等可通过增加EPCs动员或抑制EPCs细胞凋亡等途径来增强EPCs的功能[7]。相比于成熟的内皮细胞，EPCs能够主动归巢到血管损伤部位，并参与组织的再生。本实验结果显示，Ba2+、Cs+能增强EPCs的迁移、粘附功能，对于血管的新生来说增强EPCs的迁移、粘附能力具有重要的意义。另有研究显示SDF-1不仅有促进 EPCs的归巢、参与血管新生、促进骨折愈合和抗EPCs凋亡的作用，还与EPCs的粘附、迁移、增殖有关系[8]。但是本实验迁移、粘附功能增强的发生机制是否与SDF-1直接相关有待更深入的研究。

多项研究证实，EPCs具有分泌SDF-1、NO、PGI2、PAI-1、VEGF等细胞因子的功能，并在全身不同组织发挥着不同的生理作用[9]。本实验也通过基因、蛋白等方法在不同层面证实了内向整流钾通道阻断剂(Ba2+、Cs+)能促进SDF-1、PGI2的分泌。本研究还发现，SDF-1分泌的增加主要与NO信号通路相关；PGI2的分泌主要依赖于P38途径。另有研究显示SDF-1促进糖尿病大鼠EPCs向伤口部位迁移的机制也是通过NO途径来完成的[10]。SDF-1是否与NO途径有广泛的联系还需进一步的研究。除此之外，PGI2分泌的增加也具有非常重要的意义，PGI2不仅可以维持脉管系统的动态平衡，还可以抑制血小板的激活。根据实验结果我们推测，内向整流型钾离子通道阻断，影响EPCs的功能，对新血管内皮的损伤修复可能具有一定的积极作用。

综上所述，在本实验所研究浓度下Ba2+和Cs+能够改善EPCs的迁移和粘附功能，并能促进EPCs分泌SDF-1、PGI2。这可能对EPCs的临床应用具有重要的指导意义。

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Effects of inward rectifier potassium channel blockers on EPCs function

LI Wen-ping, CUI Xiao-dong, HOU Ning-ning, ZHANG Xiao-yun, LIU Jian-hua, ZHANG Jing, CHENG Min△

(Deparmeut of Endocrine, the Affiliated Hospital, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

Objective: To investigate the effects of inward rectifier potassium channel blockers (BaCl2, CsCl) on the functions of endothelial progenitor cells (EPCs). Methods: Density gradient centrifugation-isolated rat bone marrow mononuclear cells were cultured in vitro. EPCs were harvested and seeded on six culture dish when cells grew to 3～5 passages. Before testing the EPCs were synchronized with M199, which contain 2% fetal calf serum. In the end, EPCs were treated with different intervention. The experiment mainly included two parts: ①BaCl2(100 μmol/L) and free BaCl2of Tyrodes solution; ②CsCl (1 mmol/L) and control. Cell pretreated with blockers above mentioned for 12 h, then the gene expression of stromal cell-derived factor-1(SDF-1), epoprotenol(PGI2) were assessed, beyond that the ability of adhesion, migration were assayed with different tests. In addition, the medium was collected when EPCs were treated for 3 days. The levels of SDF-1 were measured by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Going even further, EPCs were treated with the signal pathway blockers in advance, after repeat the above steps, in order to analyze the change of SDF-1 and then discuss its mechanism. Results: Compared with control group, BaCl2, CsCl could increase EPC adhesion and migration to same extent. Moreover, the gene expression of SDF-1, PGI2was significantly up-regualted and the production of SDF-1 increased evidently. Furthermore, the mechanism of SDF-1 secretion increasing mainly was associated with eNOS signaling pathways. Conclusion: Ba2+and Cs+play important roles in increasing EPCs functions, such as adhesion, migration and secretion. The secretion of SDF-1 and PGI2are mainly associated with eNOS and P38 signaling pathways respectively.【KEY WORDS】 endothelial progenitor cells; inward rectifier potassium channel; function; secretion;rat

国家自然科学基金资助项目(30900290,31270993)；国家教育部“新世纪优秀人才计划” 资助项目(NCET-10-0922)；山东省自然科学基金资助项目(ZR2011CQO30，ZR2014JL018)；山东省医药卫生科技发展计划(2011QZ024)

2015-01-12 【修回日期】2015-06-05

R335

A

1000-6834(2015)05-448-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.016

△【通讯作者】Tel： 0536-8462463； E-mail： mincheng@wfmc.edu.cn