五鹤续断总皂苷抗皮肤衰老的作用及其机制*

万秋英， 宋丽君

(湖北民族学院附属民大医院， 恩施 445000)



五鹤续断总皂苷抗皮肤衰老的作用及其机制*

万秋英， 宋丽君△

(湖北民族学院附属民大医院， 恩施 445000)

目的：研究五鹤续断总皂苷抗皮肤衰老的作用及其机制。方法：将48只小鼠随机分为空白对照组、模型组、五鹤续断低、中、高剂量组和阳性对照组(n=8)。采用5%D-半乳糖(0.025 ml/(g·d))颈背部皮下注射制备皮肤衰老小鼠模型，五鹤续断低、中、高剂量组灌服五鹤续断总皂苷水溶液(50 ml/(kg·d)、100 ml/(kg·d)、200 ml/(kg·d)), 阳性对照组灌服维生素E(50 mg/(kg·d))，连续给药42 d后，检测各组小鼠皮肤组织羟脯氨酸(HYP)和脂褐质(LF)的含量，血清和皮肤组织过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性与丙二醛(MDA)的含量。结果：与空白对照组比，模型组小鼠皮肤组织HYP含量明显减少，LF含量明显增多，血清和皮肤组织CAT、GSH-Px、SOD活性显著降低，MDA含量明显增加；与模型组比，五鹤续断低、中、高剂量和阳性对照组皮肤组织HYP含量明显增多，LF含量明显减少，血清和皮肤组织CAT、GSH-Px、SOD活性显著增强，MDA含量明显减少；与低剂量组比，高剂量和阳性对照组皮肤组织HYP含量明显增多，LF含量明显减少，血清和皮肤组织CAT、GSH-Px、SOD活性显著增强，MDA含量明显减少；血清和皮肤组织SOD活性与皮肤组织 HYP呈显著正相关，与LF呈显著负相关。结论：五鹤续断总皂苷具有明显的抗皮肤衰老作用，其作用机制与抗氧化损伤密切相关。

抗衰老；抗氧化酶；羟脯氨酸;脂褐质；丙二醛

五鹤续断 (dipsacus asper)为川续断科植物续断的干燥根，因产于湖北五峰县和鹤峰县而得名。研究证明其主要的活性成分-五鹤续断总皂苷，具有明确改善学习记忆能力和抗氧化抗衰老的作用[3，4]。而皮肤是机体衰老过程中最易察觉的器官，皮肤的老化程度是评价人体衰老最重要的指标[5]。为此，本文拟从延缓皮肤衰老的角度来探讨其抗衰老的作用及其作用机制，旨在为本地区五鹤续断资源的开发应用提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

五鹤续断总皂苷水溶液的制备： 用95%乙醇提取五鹤续断后, 浓缩提取液至无醇味的浸膏, 水溶解后上大孔吸附树脂柱(AB-8型大孔树脂,天津南开大学化工厂), 用香草醛-浓硫酸显色反应比色法在波长532 nm测定总皂苷的含量，并稀释成浓度为0.72 g/L五鹤续断总皂苷水溶液备用。D-半乳糖(上海恒信化学试剂有限公司)。过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)、脂褐质(lipofuscin， LF)试剂盒(南京建成生物工程研究所)

1.2 主要仪器

UV-2450分光光度仪，GL-20GII型高速低温离心机，Multikan MK3酶标仪，DW40-120低温冰箱，BS224S电子分析天平，HFJ-10内切式匀浆机。

1.3 动物分组及给药

3月龄清洁级KM雌性小鼠48只,体重(20.0±2.1)g(华中科技大学同济医学院动物中心)，随机分为6组(n=8)：空白对照组、模型组、五鹤续断低、中、高剂量组和阳性对照组。模型组、五鹤续断组和阳性对照组0.025 ml/(g·d)颈背部皮下注射5% D-半乳糖生理盐水溶液,对照组颈背部皮下注射等量生理盐水, 均连续注射42 d,造模同时,五鹤续断低、中、高剂量组分别按50 ml/(kg·d)、100 ml/(kg·d)、200 ml/(kg·d)连续灌服五鹤续断总皂苷水溶液, 阳性对照组连续灌服维生素E 50 mg/(kg·d)，空白对照组和模型组连续灌服等量生理盐水，均连续给药42 d。

1.4 血清CAT、GSH-Px、SOD、MDA的检测

分组过程中，要充分考虑学生之间的人际关系，学生相互的个体差异，尽量让小组分配均匀合理。避免评比还未开始，学生就产生负面情绪和思想。

末次给药2 h后，将小鼠摘眼球取血，置于4℃ 冰箱静置保存2 h后，3 000 r/min，离心10 min，取上清液，即为血清，于4℃保存血清备用。按试剂盒说明测定并计算血清CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA、HYP、LF的含量。

1.5 皮肤组织CAT、GSH-Px、SOD、MDA、HYP、LF的检测

采血后，脱颈椎处死小鼠，取1.5 cm×1.5 cm背部脱毛皮肤，去除皮下组织称重后，冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干，剪碎，加入冷的生理盐水(生理盐水的体积总量是皮肤重量的9倍)和少量蛋白裂解液,用内切式组织匀浆机进行匀浆(匀浆时间每次10 s，间隙30 s，连续5～6次，在冰水中进行)，将制备好的10%匀浆用冷冻离心机3 000 r/min左右离心10～15 min，取适量离心好的匀浆上清夜，按试剂盒说明测定并计算皮肤组织中CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA、HYP、LF含量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 五鹤续断总皂苷对衰老小鼠血清CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清CAT、GSH-Px、SOD活性显著降低，MDA含量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，五鹤续断低、中、高剂量和阳性对照组血清CAT、GSH-Px、SOD活性显著增强，MDA含量明显减少(P<0.05，P<0.01)；与低剂量组比较，高剂量和阳性对照组血清CAT、GSH-Px、SOD活性显著增强，MDA含量明显减少(P<0.01，表1)。

2.2 五鹤续断总皂苷对衰老小鼠皮肤组织CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量的影响

与对照组比较，模型组小鼠皮肤组织CAT、GSH-Px、SOD活性显著降低，MDA含量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，五鹤续断低、中、高剂量和阳性对照组皮肤组织CAT、GSH-Px、SOD活性显著增强，MDA含量明显减少(P<0.05，P<0.01,)；与低剂量组比，高剂量和阳性对照组皮肤组织CAT、GSH-Px、SOD活性显著增强，MDA含量明显减少(P<0.01，表2)。

GroupCAT(U/ml)GSH-Px(U/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)Blankcontrol52.07±5.4034.71±2.9097.56±6.488.44±0.27Model33.16±4.81**▲▲21.20±2.67**▲▲65.42±4.21**▲▲17.12±0.76**▲▲Low-Dipsacus39.32±4.27#▲▲25.26±3.14#▲▲80.29±8.05##▲▲14.79±1.11##▲▲Medium-Dipsacus44.01±4.70##▲27.47±2.84##▲83.66±4.28##▲▲12.26±0.43##△△▲▲High-Dipsacus46.74±4.72##△△30.89±4.08##△△91.57±4.05##△△9.68±0.54##△△Positivecontrol49.68±5.38##△△31.94±4.43##△△94.36±7.83##△△9.02±0.29##△△

CAT: Catalase; GSH-Px : Glutathione peroxidase; SOD : Superoxide ; MDA : Malondialdehyde

**P<0.01vsblank control group；#P<0.05,##P<0.01vsmodel group；△△P<0.01vslow-Dipsacus;▲P<0.05,▲▲P<0.01vspositive control

GroupCAT(U/mg)GSH-Px(U/mg)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)Blankcontrol47.42±6.1928.30±4.2785.46±6.565.82±0.47Model25.56±3.80**▲▲11.45±3.85**▲▲57.18±5.63**▲▲12.99±0.66**▲▲Low-Dipsacus31.02±4.57#▲▲15.97±2.72#▲▲67.86±6.04##▲▲10.25±0.50##▲▲Medium-Dipsacus36.68±4.76##△▲17.90±2.68##▲▲72.75±6.38##▲8.26±0.48##△△▲▲High-Dipsacus42.82±5.08##△△23.48±3.51##△△80.35±6.81##△△6.53±0.44##△△Positivecontrol44.53±5.96##△△25.04±3.32##△△82.35±7.26##△△6.36±0.42##△△

CAT: Catalase; GSH-Px: Glutathione peroxidase; SOD: Superoxide; MDA: Malondialdehyde

**P<0.01vsblank control group；#P<0.05,##P<0.01vsmodel group；△P<0.05,△△P<0.01vslow-Dipsacus;▲P<0.05,▲▲P<0.01vspositive control

2.3 五鹤续断总皂苷对衰老小鼠皮肤组织HYP、 LF含量的影响

与对照组比较，模型组小鼠皮肤组织HYP含量明显减少，LF含量明显增多(P<0.01)；与模型组比较，五鹤续断低、中、高剂量和阳性对照组皮肤组织HYP明显增多，LF含量明显减少(P<0.01)；与低剂量组比较，高剂量和阳性对照组皮肤组织HYP明显增多，LF含量明显减少(P<0.05 ,P<0.01，表3)。

GroupHYP(μg/mg)LF(μg/g)Blankcontrol47.82±5.184.70±0.35Model23.24±2.64*▲▲7.62±0.84*▲▲Low-Dipsacus32.56±3.35##▲▲6.15±0.61##▲▲Medium-Dipsacus34.28±3.88##▲▲5.98±0.80##▲High-Dipsacus39.20±4.42##△△▲5.43±0.60##△Positivecontrol45.36±5.74##△△5.24±0.52##△△

HYP: Hydroxyproline; LF: Lipofuscin

**P<0.01vsblank control group；##P<0.01vsmodel group；△P<0.05,△△P<0.01vslow-Dipsacus;▲P<0.05,▲▲P<0.01vspositive control

2.4 血清和皮肤组织抗氧化指标SOD活性与皮肤衰老指标 HYP和LF的相关性分析

血清和皮肤组织SOD活性与皮肤组织 HYP呈显著正相关((r=0.9188，P<0.01；r=0.9200，P<0.01)血清和皮肤组织SOD活性与LF呈显著负相关(r=-0.9891，P<0.01；r=-0.9692，P<0.01)

3 讨论

HYP作为皮肤胶原蛋白和弹性蛋白中的一种主要且相对恒定的氨基酸， 可稳定蛋白结构, 增加纤维韧性, 使皮肤光滑、柔顺、 有弹性，HYP的含量会随着皮肤的衰老而降低[6]。研究表明LF在细胞中沉积会导致细胞损伤，使皮肤粗糙、黯淡、无光泽，出现皱纹、色斑等，脂褐质的含量与皮肤衰老和老化程度呈显著正相关，因此，皮肤组织中HYP和LF的含量是评价皮肤衰老的可靠指标[7]。本实验发现低、中、高剂量五鹤续断总皂苷均能增加皮肤组织HYP的合成，促进皮肤损伤的修复与再生，减少脂褐质在皮肤结缔组织中的累积，且高剂量组作用效果明显强于低剂量组，说明五鹤续断总皂苷能够延缓皮肤的衰老，以高剂量组作用效果最好。

皮肤衰老的自由基学说认为，皮肤衰老与抗氧化酶的活性密切相关，生物体内抗氧化酶(CAT、GSH-Px、SOD等)活性降低会造成自由基堆积，过多的自由基与氨基酸或直接与蛋白质反应使肽键断裂，蛋白发生交联变性，蛋白酶失活，尤其是成纤维细胞羟化酶损伤会出现羟化功能障碍，羟脯氨酸生成减少，从而破坏胶原蛋白和弹性蛋白的结构与功能，使皮肤的光洁度、柔韧性和弹性下降而出现衰老[8-9]。同时活性氧会攻击生物膜上的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化损伤，其产物MDA会导致蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，形成脂褐质(LF)[10]。

本研究结果显示三种剂量的五鹤续断总皂苷都能显著提高机体抗氧化酶的活性，减少脂质过氧化产物MDA的生成，且高剂量作用最强，以SOD活性为例，通过相关性分析发现血清和皮肤组织抗氧化指标与皮肤组织 HYP呈显著正相关，与LF呈显著负相关，提示五鹤续断总皂苷抗皮肤衰老作用的机制与其抗氧化损伤密切相关。

[1] Sachs DL, Rittié L, Chubb HA,etal． Hypo-collagenesis in photoaged skin predicts response to anti-aging cosmeceuticals[J]．JCosmetDermatol， 2013， 12(2)： 108-115．

[2] Nkengne A, Roure R, Rossi AB,etal．The skin aging index: a new approach for documenting anti-aging products or procedures[J]．SkinResTechnol， 2013， 19(3)： 291-298．

[3] Yu X, Wang LN, Du QM,etal． Akebia Saponin D attenuates amyloid β-induced cognitive deficits and inflammatory response in rats: involvement of Akt/NF-κB pathway[J]．BehavBrainRes， 2012， 235(2)： 200-209．

[4] Li C, Gao Y, Tian J,etal． Long-term oral Asperosaponin VI attenuates cardiac dysfunction, myocardial fibrosis in a rat model of chronic myocardial infarction[J]．FoodChemToxicol， 2012， 50(5)： 1432-1438．

[5] 房 林, 赵振民． 皮肤衰老机制的研究进展[J]． 人民军医， 2010， 53(2)： 149-152．

[6] 谭文波， 卢义红， 谭 刚. 木瓜黄酮的抗皮肤衰老作用[J]. 中国老年学杂志，2012， 32(23): 5218-5219.

[7] 王 方， 王 灿． 白芷醇提物延缓皮肤衰老与抗氧化作用的相关性研究[J]．中国药房， 2012， 23(7)： 599-602．

[8] Knaggs H． A new source of aging [J]?JCosmetDermatol， 2009， 8(2)： 77-82．

[9] Koziel R, Greussing R, Maier AB,etal． Functional interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging[J]．JInvestDermatol， 2011， 131(3)： 594-603．

[10]高瑞英, 张秀宇, 慕 丹， 等． 中草药提取物复配化妆品乳液延缓皮肤衰老实验研究[J]． 医药导报， 2010， 29(7)： 857-860．

Study of anti-aging effect and its mechanism of total saponins of Wu-He Dipsacus asper on skin of mouse-aging model

WAN Qiu-ying， SONG Li-jun△

(Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

Objective: To Study the effect of anti-aging and its mechanism of total saponins of Wu-He Dipsacus asper on skin of mice-aging model． Methods: Forty-eight mice were randomly divided into blank control group, model group，low-Dipsacus group, medium-Dipsacus group, high-Dipsacus group and positive control group(n=8). The mouse model of skin aging was established by nape subcutaneous injection of 5%D-galactose (0.025 ml/(g·d)), the mouse of low-Dipsacus group ,medium-Dipsacus group,high-Dipsacus group were administered with total saponins of Wu-He Dipsacus asper( 50 ml/(kg·d), 100 ml/(kg·d), 200 ml/(kg·d)), the mice of the positive control group were administered with vitamin E(50 mg/(kg·d))for 42 d. The content of hydroxyproline (HYP) and lipofuscin (LF) were measured in skin of each group mice, the activity of catalase (CAT)、glutathione peroxidase ( GSH-Px)、superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) were determined in serum and skin of each group mice. Results: Compared with blank control group, the content of HYP decreased significantly and the content of LF increased significantly in skin, the activities of CAT, GSH-Px and SOD decreased significantly and the content of MDA increased significantly in serum and skin of model group; Compared with model group, the content of HYP increased significantly and the content of LF decreased significantly in skin, the activities of CAT, GSH-Px and SOD enhanced significantly and the content of MDA decreased significantly in serum and skin of low-Dipsacus group, medium-Dipsacus group,high-Dipsacus group and positive control group;Compared with low-Dipsacus group, the content of HYP increased significantly and the content of LF decreased significantly in skin, the activities of CAT, GSH-Px and SOD enhanced significantly and the content of MDA decreased significantly in serum and skin of high-Dipsacus group and positive control group; The activity of SOD in serum and skin had a significant positive correlation with the content of HYP, and a significant negative correlation with LF in skin. Conclusion: Total saponins of Wu-He Dipsacus asper have obvious effect of anti-agng on skin of mouse-aging model , its mechanism is closely related to oxidative damage.

anti-aging; antioxidase； hydroxyproline； lipofuscin； malondialdehyde

2014-07-10

2015-02-03

R285.5

A

1000-6834(2015)02-166-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.019

△【通讯作者】Tel： 15671534176; E-mail： 907903154@qq.com