超滤与醇沉对黄芪、红芪抗大鼠脑缺血的影响*

刘永琦， 王志旺， 魏舒畅， 颜春鲁， 王瑞琼， 李应东

(甘肃中医学院， 兰州 730000)



超滤与醇沉对黄芪、红芪抗大鼠脑缺血的影响*

刘永琦， 王志旺△， 魏舒畅， 颜春鲁， 王瑞琼， 李应东

(甘肃中医学院， 兰州 730000)

目的：比较超滤法与醇沉法对黄芪与红芪保护脑缺血大鼠作用的影响。方法：将大鼠分为黄芪与红芪水煎液、醇沉物、超滤物及正常、模型等组，在给药的基础上注射地塞米松来复制血瘀证模型，实验结束时结扎颈总动脉来复制脑缺血模型，通过观测脑组织代谢水平及抗氧化系统的活性，研究超滤法与醇沉法对黄芪与红芪抗脑缺血作用的影响。结果：6 g(原生药)/kg黄芪、红芪的水提取物及其水提醇沉物与超滤物可明显提高缺血脑组织中ATP的含量与SOD、CAT的活性，降低MDA的含量，6 g(原生药)/kg黄芪、红芪的水提取物及其超滤物可降低脑组织中乳酸以及脑组织含水量；与黄芪、红芪的水提物相比，在脑组织MDA与含水量、SOD、CAT的活性等方面，黄芪、红芪的水提醇沉物的作用明显减弱。结论：黄芪、红芪水提液及其醇沉液与超滤液具有明显的抗脑缺血作用且相同提取方法所得黄芪与红芪的提取物之间的作用差异不明显；醇沉法对黄芪、红芪的抗脑缺血作用有明显削弱的影响。

黄芪；红芪；醇沉法；超滤法；脑缺血；大鼠

2010版《中国药典》记载，黄芪(Radix Astragali)、红芪(Radix Hedyseri)具有相同功效，现代研究显示，黄芪有一定的抗缺血性脑损伤的作用[1]。中药水提取液目前应用最为广泛的精制方法是醇沉法，而超滤膜分离技术是近年来发展起来的除杂分离技术，在中药及其制剂的分离纯化过程中有独特的优势。本研究以黄芪与红芪为研究对象，比较醇沉法与超滤法所得黄芪与红芪提取物对血瘀合并短暂性脑缺血大鼠模型的保护作用，为制剂工艺提供药理学理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

黄芪(Radix Astragali, RA)、红芪(Radix Hedyseri, RH)，兰州复兴厚药材有限责任有限公司，批号：20120801、20121001；黄芪水煎液(Radix Astragali decoction, RA-D)、红芪水煎液(Radix Hedyseri decoction, RH-D)、黄芪超滤物(Radix Astragali Ultrafiltration, RA-U)、红芪超滤物(Radix Hedyseri Ultrafiltration, RH-U)与黄芪醇沉物(Radix Astragali alcohol solution, RA-A)、红芪醇沉物(Radix Hedyseri alcohol solution, RH-A)由甘肃中医学院中药药剂研究室提供；地塞米松，国药集团容生制药有限公司生产，批准文号：国药准字H41020035，产品批号：12102211；人参再造丸(Renshenzaizao pill, RSZ pill)，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产，批准文号：国药准字Z11020060，产品批号：1015827。乳酸(lactic acid, LD)、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate, ATP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)与考马斯亮蓝蛋白试剂盒，南京建成生物工程研究所生产，生产批号：20130425、20130411、20130425、20130424、20130405、20130503；其余试剂为分析纯。

1.2 动物

SPF级Wistar雄性大鼠，体重180～200g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物生产许可证SCXK(甘)2004-0006。SPF级实验室，许可证号为SYXK(甘)2011-0001。

1.3 仪器

Cole-Parmer LabGEN125匀浆机，北京中科科尔仪器有限公司；N-5600PC型METASH可见分光光度计，上海元析仪器有限公司生产；ZMARK酶标仪，美国BioRad生产。

1.4 受试药的制备

取黄芪与红芪各600 g，加10倍量水煎煮2次，每次90 min，合并水煎液，在4 000 r/min下离心15 min，取上清液真空干燥即得黄芪浸膏粉与红芪浸膏粉，其提取率为27.8%与31.3%。将上述浸膏粉均分为3份，第一份用蒸馏水溶解即为黄芪水煎液与红芪水煎液；第二份用蒸馏水溶解后加入3倍量的95%乙醇，冷藏24 h后过滤，滤液回收乙醇后真空干燥即得黄芪醇沉物浸膏粉与红芪醇沉物浸膏粉，其得率为16.5%与19.1%，加蒸馏水溶解即为黄芪醇沉物、红芪醇沉物；第三份用蒸馏水溶解后，在压强0.07 MPa的条件下用10 nm的膜超滤，滤液真空干燥即得黄芪超滤物浸膏粉与红芪超滤物浸膏粉，其得率分别为22.1%与28.0%，加蒸馏水溶解即得黄芪超滤物与红芪超滤物。实验时，按6 g(原生药)/kg的剂量计算上述受试药的大鼠用药量，用蒸馏水配制，冷藏备用。

1.5 造模、给药

取Wistar雄性大鼠72只，按体重分层随机分为9组(n=8)：即正常对照组(Control group)，模型对照组(Model group)，人参再造丸组(0.86 g/kg，RSZ pill group)，黄芪水煎液组(1.67 g/kg，RA-D group)、红芪水煎液组(1.88 g/kg，RH-D group)、黄芪超滤物组(1.32 g/kg，RA-U group)、红芪超滤物组(1.68 g/kg，RH-U group)、黄芪醇沉物组(0.99 g/kg，RA-A group)与红芪醇沉物组(1.15 g/kg，RH-A group)。参考相关实验方法[2]，各组大鼠按上述剂量ig相应药物10 ml/kg，正常对照组与模型对照组ig等量蒸馏水；给药后随即按0.2 mg/kg肌肉注射地塞米松1 ml/kg，正常对照组肌肉注射等量生理盐水。每天1次，连续12 d。末次给药前禁食9 h，给药1 h后用水合氯醛麻醉大鼠，分离并结扎两侧颈总动脉60 min后，处死大鼠。

1.6 取材、检测指标

完整取出脑组织，除去小脑、嗅球及低位脑干等部位，于固定位置分别取两份：第一份脑组织精密称重后烘干，再次称重，计算脑组织的含水量；第二份脑组织加入9倍量生理盐水，于冰水浴匀浆，按试剂盒说明书测定脑组织中物质代谢、抗氧化酶及氧化产物的含量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 黄芪、红芪及其纯化物对血瘀性脑缺血大鼠脑组织含水量的影响

与正常对照组比较，血瘀合并短暂性脑缺血模型大鼠脑组织含水量显著增加(P<0.01，表1)；经黄芪、红芪的水提取物、超滤物治疗后，脑组织含水量下降，与模型对照组比较差异显著(P<0.05, 0.01)，而黄芪、红芪的水提醇沉物的作用不明显。与黄芪、红芪的水提醇沉物相比，黄芪、红芪的水提取物的作用有统计学意义，显示水煎液经乙醇沉淀后对黄芪、红芪降低脑缺血大鼠脑组织含水量的作用有明显的影响。

2.2 黄芪、红芪及其纯化物对血瘀性脑缺血大鼠脑组织LD、ATP的影响

实验结果显示，血瘀性脑缺血模型大鼠脑组织中乳酸(LD)的含量明显升高，三磷酸腺苷(ATP)的含量显著下降，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表2)；黄芪、红芪的水提取物、超滤物可缓解上述变化，使脑组织中LD含量下降，ATP的含量上升，黄芪、红芪的醇沉物对ATP的含量亦有一定的提升作用，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05, 0.01)。

GroupDose(g/kg)Crudedrug ExtractContentofwaterinbrain(%)Incrementrate(%)Control--76.8±2.0 -Model--81.3±2.6**5.86RSZpill0.64-78.6±1.1#2.34RA-D6.01.6778.2±1.0##△1.82RH-D6.01.8877.9±0.8##△△1.43RA-U6.01.3278.8±0.9#2.60RH-U6.01.6878.7±0.4#2.47RA-A6.00.9979.7±1.63.78RH-A6.01.1580.1±1.94.30

RSZ pill: Renshenzaizao pill; RA-D: Radix Astragali decoction; RH-D: Radix Hedyseri decoction; RA-U: Radix Astragali ultrafiltration; RH-U: Radix Hedyseri ultrafiltration; RA-A: Radix Astragali alcohol solution; RH-A: Radix Hedyseri alcohol solution

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsalcohol solution of same crude drugs(RA-A group or RH-A group)

GroupLD(mmol/gprot)ATP(μmol/gprot)Control0.504±0.087831.93±120.57Model0.662±0.101**660.91±97.08**RSZpill0.547±0.095#784.58±113.57#RA-D0.526±0.075##812.92±117.40#RH-D0.531±0.079#806.05±105.81#RA-U0.536±0.086#799.54±114.76#RH-U0.557±0.081#781.73±94.88#RA-A0.568±0.094774.60±91.83#RH-A0.571±0.105765.03±95.37#

LD: Lactic acid; ATP: Adenosine-triphosphate; RSZ pill: Renshenzaizao pill; RA-D: Radix Astragali decoction; RH-D: Radix Hedyseri decoction; RA-U: Radix Astragali ultrafiltration; RH-U: Radix Hedyseri ultrafiltration; RA-A: Radix Astragali alcohol solution; RH-A: Radix Hedyseri alcohol solution

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.3 黄芪、红芪及其纯化物对血瘀性脑缺血大鼠脑组织抗氧化系统的影响

在复制血瘀性脑缺血模型12 d后，大鼠脑组织抗氧化酶的活性明显下降，与正常对照组比较，模型对照组脑组织中SOD、CAT的活性明显下降，而氧化产物MDA的含量显著上升(P<0.05, 0.01，表3)；经黄芪、红芪的水提取物、超滤物及醇沉物治疗后，上述抗氧化酶及氧化产物的变化得到明显的缓解(P<0.05, 0.01)；与黄芪、红芪的醇沉物相比，超滤物的抗氧化作用更强(P<0.05, 0.01)。

GroupSOD(U/mgprot)CAT(mmol/gprot)MDA(μmol/gprot)Control223.65±31.9922.08±6.0342.92±14.79Model171.30±16.97**14.96±4.80*93.89±20.33**RSZpill201.00±25.43#22.81±5.02#62.81±19.36##RA-D229.07±34.68##△29.58±7.50##△55.76±15.13##△RH-D235.58±37.20##31.25±7.93##△△53.05±14.78##△RA-U216.32±32.71##△26.12±6.82##60.99±18.66##RH-U224.72±34.14##28.23±6.94##57.92±15.87##RA-A192.58±19.67#20.22±4.92#73.46±17.06#RH-A196.41±21.45#21.08±5.46#69.94±16.33#

SOD: Superoxide dismutase; CAT: Catalase; MDA: Malondialdehyde; RSZ pill: Renshenzaizao pill; RA-D: Radix Astragali decoction; RH-D: Radix Hedyseri decoction; RA-U: Radix Astragali ultrafiltration; RH-U: Radix Hedyseri ultrafiltration; RA-A: Radix Astragali alcohol solution; RH-A: Radix Hedyseri alcohol solution

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsalcohol solution of same crude drugs(RA-A group or RH-A group)

3 讨论

中药材中有效成分的含量普遍偏低，富集有效成分、减少服用质量(或体积)是大多数药材在临床使用前处理的必须环节。水提取法是中药制剂中运用最为广泛的工艺步骤，因水价廉易得、操作方便，但中药水提取液一般体积较大，溶液中存在大量鞣质、蛋白质、粘液质、果胶、树胶、糊化淀粉等大分子物质及许多微粒、亚微粒及絮状物等，因此，在中药制剂中，分离精制是中药水提取液进一步处理的必须工艺。醇沉法与超滤法是对中药水提取液进行纯化处理的常用方法，其中醇沉法是目前应用最为广泛的一种精制方法，可将溶于水但难溶于乙醇的大分子极性化合物沉淀除去，大大降低了出膏率。但是，醇沉法除去的是否都是无效成分，越来越多的报道对此持怀疑态度[3]，此外，醇处理后的液体制剂稳定性较差，储存过程中易产生沉淀与粘壁现象。超滤膜分离技术是膜分离技术之一，可依据分子量大小通过物理分离过程即可有效除去中药提取液中大分子有机物质如蛋白质、淀粉、鞣质等，还能除去细菌、热源、病毒等杂质，在解决中药服用量大、产品粗糙等缺点方面有独特的优势[4]；由于药物有效成分一般为小分子成分，所以超滤法纯化药物时对药物活性成分的影响较小；此外，经过超滤处理后的药液制成的制剂，其质量(如澄明度)与稳定性大大提高[5]。

血瘀性脑缺血动物模型就是在注射地塞米松提高血液粘稠度的基础上，通过结扎颈总动脉来复制的脑缺血模型；一般所说脑缺血模型是通过结扎或阻塞颈动脉或脑动脉引起脑组织缺血，因为临床上脑缺血的病人血液黏稠度有不同程度的提高，所以血瘀性脑缺血动物模型与临床患者更接近，更能反应药物的临床疗效。中药黄芪与红芪具有补气升阳、利水消肿、益气固表等功效，现代研究显示黄芪对脑缺血动物有一定的保护作用[6-7]。但是，由于黄芪与红芪提取率高，服用量大、使用不方便而限制了黄芪、红芪等中药的临床应用。本次研究以黄芪、红芪的水提液及其醇沉液与超滤液为考察对象，在注射地塞米松提高血液黏稠度的基础上，结扎颈总动脉来复制血瘀性脑缺血大鼠模型，考察受试药抗脑缺血的作用及其纯化工艺对药效学的影响。实验结果显示，黄芪、红芪的水提取物及其醇沉物与超滤物可明显提高缺血脑组织中ATP的含量，黄芪、红芪的水提取物及其超滤物可降低脑组织中乳酸以及脑组织含水量，改善脑组织代谢水平。脑缺血后引发代谢紊乱，启动自由基连锁反应，导致氧自由基大量产生并造成氧化损伤[8-9]。超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶作为自由基清除剂，其活性的高低可直接反映组织清除氧自由基的能力[10]；丙二醛(MDA)作为过氧化反应的主要代谢产物，其含量可评价组织中脂质过氧化反应的强弱[11]。本次实验结果显示，黄芪、红芪的水提取物及其醇沉物与超滤物能显著提高血瘀性脑缺血模型大鼠脑组织中SOD、CAT的活性，降低MDA的含量。

同时实验结果显示，在降低缺血脑组织含水量与氧化产物、提高脑组织抗氧化酶活性等方面，黄芪、红芪水提取物及其超滤物的作用比其醇沉物的作用更明显，提示醇沉过程对黄芪、红芪的水提取液中的有效成分的含量有明显的影响。文献报道亦显示，在3倍量95%乙醇沉淀黄芪水提取液过程中，黄芪多糖几乎全部损失，黄芪甲苷的含量也明显降低[12-13]，而黄芪多糖是黄芪抗脑缺血的主要有效组分之一[14-15]。因此，在选取醇沉精制工艺时，应综合考察药材中的有效组分，保证制剂的有效性。

综上所述，黄芪、红芪的水提液及其醇沉液与超滤液具有明显的抗脑缺血作用，而改善脑组织代谢水平、提高抗氧化能力是其抗脑缺血的机制之一；相同提取方法所得黄芪与红芪的提取物之间的抗脑缺血作用未见明显差异。与水提液相比，醇沉法对黄芪、红芪的抗脑缺血有一定的削弱作用，而超滤法有效的保护了黄芪、红芪中抗脑缺血的有效组分，表明超滤法在分离提取黄芪、红芪等富含多糖等中药过程中具有明显的优势。

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The influences of ultrafiltration and alcohol sedimentation on protective effects of Radix Astragali and Radix Hedyseri against rat’s cerebral ischemia

LIU Yong-qi， WANG Zhi-wang△， WEI Shu-chang， YAN Chun-lu， WANG Rui-qiong， LI Ying-dong

(Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective: To investigate the influences of ultrafiltration and alcohol sedimentation on protective effects of Radix Astragali and Radix Hedyseri against rat’s cerebral ischemia. Methods: Using dexamethasone(im.) and ligating common carotid artery, the rat stasis model combined transient cerebral ischemia was established to evaluate the effects of the ultrafiltration and alcohol sedimentation through detecting antioxidant system and other indexes in brain tissue. Results: The results showed that the 6 g/kg water extract(crude drug), ultrafiltration and alcohol sedimentation of Radix Astragali and Radix Hedyseri could upgrade adenosine-triphosphate(ATP), superoxide dismutase(SOD) and catalase(CAT), and degrade malondialdehyde(MDA) and water content of brain tissue in rat stasis model combined transient cerebral ischemia, the water extract and ultrafiltration of them could degrade lactic acid(LD) of brain tissue, and the effects of alcohol sedimentation of Radix Astragali and Radix Hedyseri become weaker than water extract of them. Conclusion: The water extract, ultrafiltration and alcohol sedimentation of Radix Astragali and Radix Hedyseri have some protective effects on cerebral ischemia in rats, the effective differences of the extract through the same extraction method are not remarkable, and alcohol precipitation method has obvious influences effect on Radix Astragali and Radix Hedyseri.

Radix Astragali(RA); Radix Hedyseri(RH); alcohol precipitation method; ultrafiltration; cerebral ischemia; rat

2014-08-18

2014-10-14

R285.5；R742.3

A

1000-6834(2015)02-132-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.010

△【通讯作者】Tel: 0931-8765395; E-mail: wzw0933@126.com