转Bt+Epsps基因稻谷对小鼠肠道菌群多样性的影响

王开诚

湖南省娄底市第一中学

转Bt+Epsps基因稻谷对小鼠肠道菌群多样性的影响

王开诚

湖南省娄底市第一中学

本研究以昆明小鼠为实验对象，以传代实验为基础，在饲喂不同含量的转Bt＋Epsps基因稻谷和等量同品种常规稻谷后取小鼠进行实验分析，发现亲、子代各组小鼠肠道微生物DNA在电泳条带上略有差异，但未达显著性水平；菌落数和电泳条带的相似度大，差异不显著。

双价抗虫抗除草剂基因（Bt+Epsps）；DGGE;相似性指数

一实验方法

1.肠道微生物样品采集

随机抽取30日龄小鼠5只以摘除眼球放血致死，用70%的酒精将其体表消毒、在无菌条件下解剖。将同一组5只鼠剩余的回肠和盲肠肠腔内容物均匀混合，取1g迅速注入对应无菌离心管中，于-70℃保存备用。

2.培养

根据肠道常见微生物的不同营养需求，配制选择培养基，样品涂布到择培养基上后置于恒温箱中培养24小时，长出菌落后，选择平皿中菌落数量在30-300间的菌落计数，计算出每克原始样品中所含菌落总数。

3.样品前处理

样品经室温解冻样品后，各取1g左右肠道内容物用1.5m l磷酸盐缓冲溶液，悬浮沉淀，反复离心，直到上清液澄清为止。最后以1.0m lPBS悬浮所收沉淀，置于EP管中-70℃保存。

4.DNA的提取

将上述样品以12000r/min的速度离心5min，除去上清液，按照DNA提取试剂盒操作步骤提取，提取物在-20℃保存备用。

5.DNA的定量和纯度检测

用DNA定量仪测定DNA含量，以OD260/OD280值评价DNA的纯度，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。

6.PCR扩增

用细菌通用引物对细菌16SrDNA的V3区序列进行PCR扩增。PCR扩增所用引物由上海生物工程有限公司合成。经35次循环后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

7.变性梯度凝胶电泳

将PCR产物用变性梯度凝胶电泳仪于8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，用AgNO3染色，显色定影后用凝胶成像扫描系统照相。

8.主要优势菌群的鉴别

用一次性手术刀从DGGE胶中切去目的条带、离心管、PCR扩增、电泳检测后，回收、纯化目的片段，送捡、测序。

二、结果与分析

1.实验室培养

将被检样品计数菌落数、单因素方差分析。可知：亲子代各组肠道微生物除乳杆菌差异显著（P＜0.05）,其余各指标差异不显著（P＞0.05）。

2.DGGE条带分析

各样品经DGGE分离显示出了数目不等的电泳条带(见图1)，每个条带至少代表一个菌种，条带的粗细代表微生物的浓度，条带越粗（如条带4、7等）表明该微生物菌群含量越高，反之越低。由图3可知，条带在强度和迁移率方面存在一定的差异，不同组之间既有共同条带（如条带1、4、7、8、10等），也有特异条带（如条带2、3等）。条带2、3在亲代1、2、3、4组表现明显，在阴性组和子代表现不明显，可能与小鼠食用稻谷后，对小鼠肠道环境有一定影响，有利于某些微生物生长，随着食用代数增加，小鼠逐渐适应口粮，这些微生物数量减少。而4号条带在阴性组和子代各组表现明显，可能与小鼠食用稻谷后，对小鼠肠道环境有一定影响，不利于某些微生物的生存，随着食用代数增加，小鼠逐渐适应口粮，肠道环境

逐渐改善，这些微生物数量恢复正常。

1234 51’2’3 4’5’

图1 小鼠肠道微生物DGGE电泳条带分布情况。亲代1-5组，子一代1’-5’组。

3.相似性分析

亲代和F1代各组小鼠肠道微生物菌群相似性系数(CS)如表1。亲代和F1代1组、3组和5组之间，2组、4组和5组之间小鼠肠道微生物菌群相似性系数为77%～81%，相似程度大，无显著性差异（P＞0.05）。

表1 小鼠肠道微生物主要菌群相似性系数/%（平均值±标准差）

4.主要优势菌群

将如图1所示的1～10号条带的16SrDNA序列在NCBI上进行Blast比对，结果显示小鼠肠道微生物的主要优势菌群有：1—加氏乳酸杆菌；2，3，9—非培养的未知细菌；4—约氏乳酸杆菌；5—缓慢葡萄球菌；6—科氏葡萄球菌；7—肠乳杆菌；8—鼠乳杆菌；10—施氏葡萄球菌。

三、小结

实验发现乳酸杆菌数量在各组间差异显著，这与DGGE电泳条带上4号条带在亲代40%转、40%常、60%转、60%常不明显、而阴性和子代各组条带特别明显是一致的。说明饲料中的稻谷对肠道环境有一定影响，但这一影响不一定是转基因造成的。肠道微生物基因组DNA在DGGE图谱中，条带数和位置较复杂，体现了小鼠肠道微生物的多样性。实验确定的小鼠肠道微生物的主要优势菌群，属于厌氧菌的有乳酸杆菌，属于需氧菌的有葡萄球菌、肠乳杆菌、鼠乳杆菌。这些优势菌群是哺乳动物肠道正常的细菌，与祝小枫等的研究结果一致。

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