广西省猪繁殖与呼吸综合征病毒GP2、GP3、GP4蛋白遗传进化分析

贺 微，韦 莹，黄加滨，洪绍锋，林思远，姚 静，陈 樱，黄伟坚,韦祖樟

（广西大学动物科学技术学院，南宁 530005）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的一种接触性、病毒性传染病，以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征[1]。PRRS 自1987年首次报道以来，现已遍及世界许多国家和地区，成为危害养猪业最严重的传染病之一。

PRRSV为动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的单股线状正链RNA病毒，基因组全长约15 kb，非编码区含有5'端“帽子”结构和3'端poly（A）尾巴；编码区含有9个开放阅读框（open reading frame，ORF）：ORF1分为ORF1a和ORF1b，编码 RNA复制酶[2]；ORF2～ORF5编码病毒的5种糖基化膜糖蛋白，分别为GP2a、GP2b、GP3、GP4和GP5；ORF6编码非糖基化的膜基质蛋白（M蛋白）；ORF7编码核衣壳蛋白（N蛋白）[3,4]。根据遗传特性的差异，PRRSV可划分为欧洲Ⅰ型（Lelystad virus，LV）和美洲Ⅱ型（VR-2332）两个基因型（genotype），两者之间基因组差异约40%，同型病毒间的亚型基因组差异也可高达20%[5,6]。GP2a蛋白有两个保守的天门冬酰胺，形成两个糖基化位点，该位点对病毒感染是非必需的；GP2b蛋白有协助病毒复制的作用，对PRRSV粒子的脱壳、释放都起到一定作用，但无法装配病毒[7]，同时GP2b蛋白具有离子通道，对病毒的感染是必需的[8]。Chen等[9]已经证实GP2的C端存在10个氨基酸的缺失，但目前GP2的缺失对病毒的致病性和毒力方面的影响尚未深入研究。GP3蛋白有7个N-糖基化位点，是PRRSV欧洲株和美洲株中突变性最高的蛋白之一[10]。最新研究表明，SH1211毒株在ORF3的203－208位点上缺失6个核苷酸或缺失67、68位点2个氨基酸[11]。另有研究发现，GP3 N端多聚糖有干扰机体产生中和抗体作用[12]。GP4含有4个糖基化位点，其N端和C端具有高度的疏水区，这些位点在美洲株和欧洲株之间都是保守的[13]。

目前，PRRSV遗传进化的研究主要还是集中在GP5、M和N蛋白，对GP2、GP3和GP4的研究并不多。研究表明次要蛋白GP2、GP3和GP4在与细胞受体CD163结合以及诱导机体产生中和抗体的过程起到重要的作用[14]。因此，本研究对11株广西省分离到的PRRSV进行ORF2、ORF3和ORF4基因的克隆、序列测定及遗传变异特征分析，有助于揭示PRRSV的遗传进化规律，为今后预防和控制PRRS提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 病毒、菌种及质粒 11株PRRSV均为本实验室分离、保存；pMD18-T vector克隆载体购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α购自康为世纪公司。

1.2 主要试剂 TrizolRNA 提取液购自上海生工生物工程有限公司；TaqMix、dNTP、RNase Inhibitor、M-MLV等购自大连宝生生物公司（TaKaRa）产品；DNA纯化回收试剂盒购自OMEGA公司。

1.3 引物设计与合成 将PRRSV ORF2、ORF3和ORF4基因分为两个片段扩增，参考美洲经典株VR-2332、中国标准株CH-1a和HP-PRRSV毒株JXA1相对应在ORF2、ORF3和ORF4基因的共同保守核苷酸序列片段来设计引物（表1）。引物在上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table1 Primers used in this study

1.4 病毒RNA提取及 RT-PCR 选用本实验室保存的阳性细胞毒，采用Trziol 法抽提病毒总RNA。取RNA模板16.0μL，加入随机引物9N、18T各1.0μL，5×M-MLV Buffer 5.0μL，dNTP Mixture 2.0μL，RNasin Inhibitor 0.5μL，M-MLV Reverse Transcriptase 0.5μL，42℃ 1 h，即得到cDNA。PCR反应体系如下：TaqMix 12.5μL、ddH2O 8.5μL、上下游引物分别0.5μL、cDNA 3.0μL。PCR反应程序：94℃预变性 5min；95℃变性 1min，56℃退火 1min，72℃延伸 1.5min，30个循环；72℃再延伸6 min。

1.5 PCR产物回收、克隆及序列测定 将纯化产物与pMD18-T载体4℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，扩大培养。菌液PCR鉴定：将菌液作为模板，以SF12145/SR13152、SF13106/SR13950引物验证目的基因片段。反应体系和程序同1.4。经鉴定的阳性菌液送上海杰李生物有限公司进行序列测定。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果及菌液PCR鉴定 本研究将目的基因分为两个片段扩增，第一片段为1007 bp（图1），第二片段为844 bp，均与预期扩增长度一致（图2）。菌液PCR获得的基因片段与目的基因大小相符。

图1 第一片段目的基因扩增结果Fig.1 Amplification of the first gene fragment

图2 第二片段目的基因扩增结果Fig.2 Amplification of the second gene fragment

2.2 序列分析及同源性比较 运用DNAStar软件分析测定序列，分别获得771、765、537 bp的ORF2、ORF3、ORF4的完整基因序列，将所得序列在NCBI BLAST网站进行比对，确认为PRRSV序列。同时运用DNAStar软件将11株PRRSV与GenBank发表的毒株进行氨基酸同源性比对，并用MEGA5.03软件对11株PRRSV构建系统遗传进化树。结果表明，11株PRRSV的GP2、GP3、GP4氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.6%、95.3%～100%、93.9%～100%。与美洲型代表毒株VR-2332氨基酸同源性分别为91.4%～93.0%、85.1%～86.7%、89.4%～91.1%；与中国经典毒株CH-1a同源性为分别为94.2%～96.1%、91.8%～92.9%、95.0%～98.9%；与我国HP-PRRSV毒株JXA1、TJ、WUH4、HUN4同源性分别为96.1%～99.6%、95.3%～98.8%、95.0%～99.4%；与10-10GX-1毒株同源性为94.4%～99.2%；与欧洲代表毒株Lelystad virus序列同源性最低，仅为55.9%～72.6%。

将11株PRRSV GP2、GP3、GP4 氨基酸序列与美洲型代表毒株VR-2332和HP-PRRSV毒株JXA1、HUN4进行变异位点分析发现：PRRSV GP2与HP-PRRSV毒株在F9→S9、S24→F24、L32→S32、P42→Q42、T91→V91、S141→G141、M174→L174、V235→I235、I237→M237、T240→S240、S253→L253、Q257→W257出现相同的突变。除GXNN1310b的其余10株PRRSV均出现I118→V118，而在所有参考株中并未出现过该变异。10-10GX-1、GXNN1310b毒株出现N188→G188的一致变异（图3）。

PRRSV GP3与HP-PRRSV毒株存在多个相同的突变位点，如V2→A2、C13→R13、G27→N27、Y32→F32、T48→M48、P56→L56、L58→P58、T64→A64、Y67→L67、R71→K71、L73→F73、E83→S83、I95→V95、E147→V147、Q151→D151、N206→S206、R223→H223、K230→R230、I237→M237、V252→A252，其中213～216位从“LQIL”→“FRTS”。经典美洲型毒株的GP3蛋白中存在两个重要的B细胞表位即Y67EPGRSLW74和W74CRGHDRCGED85，11株PRRSV在这两个表位出现了5个氨基酸的突变且变异与HP-PRRSV毒株相同。此外，GP3蛋白的第83位氨基酸被推测与毒力相关，而11株PRRSV的83位点相应位置都被置换成S83，与我国HP-PRRSV毒株相同，通过此位点可推测11株PRRSV为强毒力毒株（图4）。

PRRSV GP4与HP-PRRSV毒株也存在V9→L9、L15→F15、L16→V16、A32→S32、A42→S42、R56→G56、A59→S59、E61→P61、A62→T62、V79→I79等多个相同位点的变异。GXNN1310b和10-10GX-1毒株均在3-5位点由“SSL”→“APF”，并出现A45→I45的相同变异（图5）。

图3 GP2氨基酸序列比对分析Fig.3 Alignment analysis of amino acids sequences of GP2

对11株PRRSV GP2、GP3、GP4氨基酸序列与VR-2332、RespPRRS MLV、Lelystad virus、CH-1a、JXA1、HUN4、10-10GX-1、GD3等代表毒株的相应序列构建遗传进化树发现，如图6、7、8所示，11株PRRSV GP2、GP3、GP4氨基酸序列全部分布在美洲型分支上，且与我国HP-PRRSV毒株JXA1、HUN4有较高亲缘性。三个进化树中GXNN1310b、10-10GX-1处于相同的亚分支下，两者亲缘关系最接近。

3 讨论

本研究以2013～2014年在广西省各地区分离的11株PRRSV的GP2、GP3、GP4蛋白为研究对象，对其遗传变异特征进行分析。分析表明，11株PRRSV GP2、GP3、GP4蛋白氨基酸同源性分别为94.6%～99.6%、95.3%～100%、93.9%～100%；与美洲经典毒株VR-2332 GP2、GP3、GP4氨基酸同源性分别为91.4%～93.0%、85.1%～86.7%、89.4%～91.1%；与我国HP-PRRSV 毒株对应氨基酸的同源性分别为96.1%～99.6%、95.3%～98.8%、95.0%～99.4%。

序列比对分析表明：11株PRRSV GP2、GP3和GP4氨基酸序列参考美洲经典毒株VR-2332和HPPRRSV毒株JXA1、HUN4，未出现缺失仅存在多处点突变。在GP2氨基酸序列比对中，除GXNN1310b毒株之外，其余10株PRRSV均在I118→V118出现变异，而在所有参考株中并未出现过该变异，该变异是否对病毒的毒力和致病性产生影响，仍需深入研究。在GP3氨基酸序列中，第83位点的G83被推测是与毒力相关的位点[15]，11株PRRSV的该位点均与HP-PRRSV 毒株一致被置换为S83，而其弱毒疫苗株PespPRRS MLV该位点为E83，推测11株PRRSV为强毒力毒株。

图4 GP3氨基酸序列比对分析Fig.4 Alignment analysis of amino acids sequences of GP3

图5 GP4氨基酸序列比对分析Fig.5 Alignment analysis of amino acids sequences of GP4

图6 PRRSV GP2氨基酸序列的进化树分析Fig. 6 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of PRRSV GP2

图7 PRRSV GP3氨基酸序列的进化树分析Fig. 7 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of PRRSV GP3

图8 PRRSV GP4氨基酸序列的进化树分析Fig. 8 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of PRRSV GP4

遗传进化结果进一步表明，11株PRRSV均属于美洲型，且均为HP-PRRSV毒株。GXNN1310b和10-10GX-1毒株在遗传进化树中处于同一亚支，且二者同源性达98.3%以上，推测GXNN1310b可能是从10-10GX-1毒株发展而来。

本研究通过对广西省分离的11株PRRSV的GP2、GP3和GP4蛋白的遗传变异特征进行分析，证实了当前广西省以流行HP-PRRSV 毒株为主，且在自然环境和免疫压力作用下出现了多处氨基酸突变，但突变氨基酸有何生物学意义仍需进一步研究。因此，为有效控制PRRS，应加强对该区PRRS的分子流行病学调查、监控，深入研究病毒的致病机理及免疫机制，为研制更高效、更有针对性的疫苗提供一定科学依据。

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