茚虫威对斑马鱼的急性毒性及遗传毒性

冯青，赖柯华，黄伟康，刘禹杉，李江，章程辉，范咏梅

海南大学环境与植物保护学院，海口 570228

茚虫威对斑马鱼的急性毒性及遗传毒性

冯青，赖柯华，黄伟康，刘禹杉，李江，章程辉，范咏梅*

海南大学环境与植物保护学院，海口 570228

茚虫威属噁二嗪类新型广谱高效杀虫剂，在农业生产中有着重要作用，近年来随着用量的增加，由此产生的对水生生物的影响越来越受到重视。使用斑马鱼进行茚虫威的急性毒性作用实验，并采用微核试验、彗星试验、Annexin V-FITC/PI双染色检测观察染毒后的斑马鱼是否被诱导产生遗传毒性。结果表明：在24 h、48 h、72 h、96 h，茚虫威LC50值分别为2.263 mg·L-1、2.184 mg·L-1、2.184 mg·L-1、2.133 mg·L-1。茚虫威对斑马鱼急性毒性属中等毒性。96 h茚虫威浓度为1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1时，斑马鱼的微核率与对照组相比达差异极显著水平(P<0.01)。采用彗星试验检测斑马鱼肝脏DNA损伤，结果显示斑马鱼暴露于高浓度1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1茚虫威后，与对照组相比，斑马鱼的DNA损伤均表现为极显著差异(P<0.01)。采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪法检测，结果表明染毒后24 h斑马鱼肝细胞出现细胞凋亡现象。实验结果进一步表明，茚虫威对斑马鱼短期染毒后诱导细胞凋亡，表现出遗传毒性。

茚虫威；斑马鱼；急性毒性；遗传毒性；凋亡；微核试验；彗星试验；Annexin V-FITC/PI

茚虫威(indoxacarb)，美国杜邦公司于1992年开发的新型钠通道阻断型氨基甲酸酯类杀虫剂，用于棉花、果树、蔬菜和林木等作物[1]。随着该药剂专利保护于2011年12月21日到期[2]，国内很多厂家开始生产该药剂的原药和母药，该药剂在国内的销售量大幅度增加，故茚虫威在水体和环境中的残留及影响不容忽视。

在环境毒理的研究中，农药、工业污水等对脊椎动物作用方面，斑马鱼已成为一种极好的实验模式动物[3-4]。而在茚虫威对斑马鱼作用的研究方面，国内学者有做茚虫威(SC)对斑马鱼的急性毒性研究[5],以及该商品药与表面活性剂对斑马鱼的急性毒性和联合毒性研究[6]。在国外的相关研究中，仅见联合国粮农组织(FAO)[7]、澳大利亚国家农药和兽药注册局 (NRA)[8]、欧盟委员会卫生与消费者保护总署[9]等对茚虫威原药的评估报告，其中蓝鳃太阳鱼的LC50是0.9 mg·L-1、虹鳟鱼的LC50为0.65 mg·L-1、鲤鱼的LC50为0.969 mg·L-1，鲶鱼的为0.29 mg·L-1，并采用茚虫威对沙门氏菌、中国仓鼠卵巢细胞、大鼠的肝细胞、人类淋巴球、鼠的骨髓细胞进行处理，检测其基因诱变的情况，结果显示为阴性。综上所述，关于茚虫威原药对斑马鱼的急性毒性、遗传毒性的研究在国内外均无明确报道。而农药对生物的遗传毒性的影响也越来越受到重视，有学者研究发现，农药能引起DNA损伤[10-11]。

本研究采用微核试验和彗星试验检测是否存在DNA损伤，用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪法检测细胞凋亡。其中微核试验已广泛应用于药品、农药、环境污染物等遗传毒性的检测[12]，彗星试验又称为单细胞凝胶电泳，是被普遍应用于毒理学上有核细胞DNA损伤和修复的检测方法[13-14]；Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪法是目前定量检测细胞凋亡的理想方法[15]。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 实验材料

斑马鱼(Brachydanio rerio)为AB系斑马鱼，引进自国家斑马鱼中心。挑选同一批生长为6个月，且体态健康的斑马鱼。其平均体长2～3 cm，平均体重0.2 g，无死亡情况。实验前24 h及实验期间不喂食。

实验用水为曝气24 h以上的去氯自来水，温度(25±1) ℃，实验过程中测定实验用水的pH为7.4～8.2，溶氧量为85%～90%。

1.2 供试药品

茚虫威(含量98%，南京乐邦化工有限公司)、高锰酸钾(GR，广州化学试剂厂)、乙酸乙酯(AR，广州化学试剂厂)、吐温80(索莱宝科技有限公司)、胰蛋白酶消化液(北京索莱宝科技有限公司)、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒G002-1(南京建成生物工程研究所)、GelRed核酸染料(北京博迈德科技发展有限公司)

1.3 斑马鱼急性毒性试验

斑马鱼急性实验参考《OECD,Guidelines for the testing of chemicals，Fish acute toxicity test》[16]进行。根据预实验的结果，正式实验设置茚虫威浓度为1.65、1.81、1.97、2.16、2.36 mg·L-1，设曝气水空白对照和溶剂对照。每个实验容器中放入10尾斑马鱼。分别在24 h、48 h、72 h、96 h时检查受试斑马鱼的存活状况及溶氧量和pH值。同时选取重铬酸钾(GR)作为参比物，重铬酸钾浓度分别为100、150、225、338、506 mg·L-1，测定斑马鱼的敏感性24 h-LC50。

1.4 微核试验

从每个浓度中随机取3只试验鱼。用滤纸拭去斑马鱼表面的水，断尾，用经过肝素钠湿润过的毛细血管吸取外周血液，滴至洁净的载玻片上，常规操作制取血涂片，每尾鱼制取2张片，待晾干后用甲醇固定10 min左右，再用10%吉姆萨(Giemsa)溶液液染色25 min，立即用pH=6.8的磷酸缓冲液冲洗干净，晾干后，使用显微镜OLYMPUS BX51图像分析软件Image-Pro Plus 6.0观察并拍照。每张玻片统计3 000个细胞，并按下列公式计算微核细胞的千分率[18]。

微核率=观察到的微核细胞数 / 观察的细胞总数×1000‰

1.5 Annexin V-FITC/PI检测

解剖出斑马鱼幼鱼肝脏，采用胰蛋白酶消化液在室温下消化20～30 min，再以血清封闭，停止消化，200目筛网过滤。离心后，PBS轻轻重悬，并计数，细胞数应不低于1×105个检测方法参照试剂盒说明书进行，采用FACSCanto流式细胞仪(BD公司)检测。

表1 茚虫威对斑马鱼的毒性Table 1 Indoxacarb toxicity to B.rerio

图1 对照组及茚虫威实验组受试斑马鱼微核图

图2 斑马鱼外周血红细胞核异常现象

表2 茚虫威对斑马鱼外周血红细胞微核率的影响Table 2 Effects of indoxacarb on micronucleus of peripheral red blood cells in B.rerio

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05);**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

Note: *indicate significant differences compared with comparison group(P<0.05);**indicate extremely significant differences compared with control group (P<0.01).

1.6 彗星试验

按1.5步骤制备肝脏悬浮液，参考侯欣欣[17]的实验方法并进行改进，制备单细胞凝胶电泳胶板，细胞裂解1 h，碱性解旋20 min，在电压25 V，电流300 mA，4 ℃条件下避光电泳20 min。中和碱性后，酒精逐级脱水，用GelRed 100×对其染色，紫外光下用显微镜OLYMPUS BX51 图像分析软件Image-Pro Plus 6.0观察并拍照。

1.7 数据分析

使用SPSS Statistics 17.0软件，计算24 h、48 h、72 h、96 h的LC50值、相应95%置信区间并进行回归分析，以R2表示相关程度。对不同处理组之间实验结果进行差异显著性分析和回归分析，以相关系数R表示相关程度。

2 结果(Results)

2.1 斑马鱼的急性毒性效应

本实验结果显示：96 h时LC50值为2.13 mg·L-1，置信区间为1.64～2.60 mg·L-1，进行线性回归y=10.99x-19.68，其中R2为0.87，相关性良好(表1)。24 h-LC50到96 h-LC50由2.24 mg·L-1减少至2.13 mg·L-1，表明随着时间的增长，茚虫威对斑马鱼的毒性也随之升高。

2.2 微核试验

茚虫威药剂处理后的斑马鱼，其外周红细胞出现微核(图1)。微核的千分率的统计结果表明(表2)，与阴性对照组比较，受试组浓度为1.65、1.81、1.98、2.16 mg·L-1的斑马鱼细胞微核率分别为：9.65‰±1.36‰，10.14‰±0.71‰，12.67‰±1.03‰，15.37‰±2.24‰。

结果表明，未成熟红细胞与成熟红细胞总数目比值(PCE/NCE)在0.8～1.1之间。当受试浓度为1.65 mg·L-1和1.81 mg·L-1，微核率升高，但与对照组差异不显著；浓度为1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1时，微核率上升幅度较大，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。对红细胞微核率进行回归分析，其回归方程为Y=0.023X-0.02 (R=0.86)。

微核试验中，除微核外也观察到了，核质外凸型的核异常中微核与主核之间有细丝相连的现象，比例小于0.1% (图2)。

2.3 彗星试验

采用不同浓度茚虫威对斑马鱼幼鱼处理后，其肝脏细胞出现不同程度的DNA损伤(图3)。由表3可知，茚虫威对斑马鱼肝脏细胞DNA彗星Olive尾矩的影响，在24 h时，在1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1时彗星尾矩的值与对照组相比呈极显著差异(P<0.01)；48 h时各浓度的彗星尾矩明显增加，在与对照组相比，均表现为极显著差异(P<0.01)，且在1.98 mg·L-1浓度时，DNA的损伤最大。72 h和96 h时，各浓度的彗星尾矩与对照组相比均表现出及显著性差异(P<0.01)。

同一浓度处理，随着时间的变化其DNA彗星Olive尾矩也存在差异，暴露24 h时，茚虫威对斑马鱼肝脏的DNA损伤处于较低水平；在48 h DNA彗星Olive尾矩出现最大值；72 h和96 h时DNA彗星Olive尾矩较48 h时有所减少。

图3 斑马鱼肝脏细胞DNA损伤的彗星实验图像

表3 茚虫威对斑马鱼肝脏细胞DNA损伤程度(Olive尾矩)的影响Table 3 Effect of indoxacarb on B.rerio liver comet olive tails

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05);**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

Note: *indicate significant differences compared with control group(P<0.05);**indicate extremely significant differences compared with control group (P<0.01).

表4 不同时间段不同茚虫威浓度下斑马鱼肝脏的细胞凋亡率Table 4 The apoptotic result of liver cells in B.rerio at different time treated with different concentration of in indoxacarb

注：**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

Note:**indicate extremely significant differences compared with control group (P<0.01).

图4 不同浓度茚虫威暴露24 h对斑马鱼肝脏细胞凋亡的影响

图5 不同浓度茚虫威暴露96 h对斑马鱼肝脏细胞凋亡的影响

2.4 Annexin V-FITC/PI检测

由图4和表4的Annexin V-FITC/PI检测结果可知，与对照组相比，在药剂处理斑马鱼24 h后，其肝脏细胞出现细胞凋亡现象，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.98 mg·L-1、2.16 mg·L-1组的细胞凋亡率分别为18.30%、22.50%、27.00%和30.40%，与对照组相比存在极显著差异。肝脏细胞凋亡率随着茚虫威浓度的增加呈递增趋势，且茚虫威浓度与斑马鱼肝脏细胞凋亡率R=0.99(P<0.01)。

在处理后48 h，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.97 mg·L-1、2.16 mg·L-1组的细胞凋亡率分别为2.10%、0.40%、3.70%和0.70%(表4)，空白对照和溶剂对照保持在较低水平，斑马鱼肝脏细胞凋亡率与茚虫威浓度，不存在剂量-效应关系(R=-0.83，P<0.05)。茚虫威处理72 h后，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.97 mg·L-1、2.16 mg·L-1组的斑马鱼肝脏细胞凋亡率分别为3.20%、0.50%、0.60%和3.60%，空白对照和溶剂对照也保持在较低水平，斑马鱼肝脏细胞凋亡率与茚虫威浓度不存在剂量-效应关系(R=0.13，P<0.05)。

茚虫威处理后96 h时，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.98 mg·L-1、2.16 mg·L-1组的细胞凋亡率分别为0.50%、0.80%、3.60%和7.00%(如图5、表4)。在1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1肝脏细胞凋亡率与对照相比差异极显著。

3 讨论(Discussion)

本研究结果表明，急性毒性试验中，阳性对照重铬酸钾对斑马鱼的24 h-LC50值为241 mg·L-1，在200～400 mg·L-1之间，参比物重铬酸钾试验结果证明斑马鱼的敏感性满足实验所需，符合OECD的标准[17]。茚虫威原药对斑马鱼幼鱼的急性毒性96 h-LC50值为2.13 mg·L-1，95%置信区间为1.64～2.60 mg·L-1，属中毒范畴。俞瑞鲜等[5]在茚虫威商品药(15%茚虫威悬浮剂)对斑马鱼影响的研究中测得96 h-LC50的值为0.37 mg·L-1，95%置信区间为0.37～0.46 mg·L-1，属高毒范畴。说明茚虫威原药的毒性低于商品药，这种因溶剂的不同而实验结果不同的情况在农药急性毒性研究中比较常见，如甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对斑马鱼的毒性也是如此[18-19]。

在遗传毒性物质的诱导下，真核生物细胞会出现微核和核异常的现象。农药在急性试验中常会诱导鱼类微核率和核异常率的上升，造成遗传损伤，如草甘膦[20]，戊氰菊酯[21]、拉特拉津[22]等。在本研究的微核试验中，未成熟红细胞与成熟红细胞总数目比值(PCE/NCE)在0.8～1.1之间，均属于正常范围(0.6～1.2)。96 h时处理组1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1的斑马鱼外周血细胞的微核率明显增多，并与对照组的差异达极显著水平。同时观察到微核与主核之间有细丝相连的核外突的核异常现象(如图2)，可能是茚虫威对细胞核产生毒性，导致核外突而形成微核，这也符合以主核外突形成微核的学说[23-24]，其他学者在鲫鱼[25]、黄鳝[26]的外周血细胞的微核和核异常的研究中也验证了上述学说。本试验结果表明，茚虫威可以诱发斑马鱼幼鱼外周血细胞微核和核异常，具有潜在的遗传毒性。

彗星试验中，彗星迁移的远近与松动释放的多少并不完全一致，本实验参考Olive尾矩(Olive tail moment)，能够更加全面地评价DNA的损伤程度[27]，在吡虫啉、噻虫嗪[10]、毒死蜱[17]和莠去津[28]等对斑马鱼肝脏DNA损伤的研究中，采用此指标评价农药对斑马鱼的DNA损伤。在48 h时，茚虫威对斑马鱼肝脏的DNA损伤达到最大值，细胞核变得疏松，体积也逐渐变大。在72 h和96 h时，低浓度的1.65 mg·L-1和1.81 mg·L-1处理的肝脏细胞DNA损伤虽有所恢复，但和对照组相比差异仍极显著。斑马鱼暴露于高浓度1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1茚虫威后斑马鱼的肝脏DNA损伤均表现为极显著差异，进一步表明茚虫威对斑马鱼存在遗传毒性。

Annexin V-FITC/PI双染法[29]等可检测早期少量细胞凋亡。该方法使用能特异性结合凋亡时外翻的细胞膜磷脂酰丝氨酸[30]的AnnexinV作为探针，并且，利用碘化丙啶(PI)不能透过完整细胞膜的特点，可以将凋亡细胞、坏死细胞、损伤细胞与正常细胞区别开，武凡等[31]也证实此方法是理想的定量检测肝细胞凋亡的方法。本研究结果表明在24 h时，斑马鱼肝脏细胞凋亡率明显升高，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.98 mg·L-1、2.16 mg·L-1组的细胞凋亡率分别为18.3%、22.5%、27%和30.4%，与对照组相比凋亡率存在显著性差异。在24 h时茚虫威诱导肝脏细胞凋亡，且斑马鱼肝脏细胞凋亡率与茚虫威浓度相关性显著(R=0.99，P<0.01)，凋亡率随着茚虫威浓度的升高而增加。

本试验结果表明，茚虫威短时间暴露即会造成DNA损伤，并于24 h诱导斑马鱼幼鱼产生早期细胞凋亡现象。

本研究中，茚虫威对斑马鱼幼鱼实验为短期暴露实验，而长时间低剂量暴露是否会产生细胞凋亡的现象，或者是否存在其他遗传毒性等问题则需要进一步的研究。

致谢：感谢海南大学环境与植物保护学院农药环境毒理学实验室和海南大学海口市环境毒理学实验室的同学们对本实验的帮助和支持。

[1] 陈锦露,张芝平,张一宾.新颖氨基甲酸酯类杀虫剂—茚虫威(indoxacarb)的合成与应用[J].浙江化工,2005,36(1): 30-32

Chen J L,Zhang Z P,Zhang Y B.Synthesis and application of indoxcacarb—The novel inseciticide containing carbamate [J].Zhejiang Chemical Industry,2005,36(1): 30-32 (in Chinese)

[2] 唐永军.2011年-2015年专利到期的农药品种之茚虫威[J].今日农药,2012(4): 39-42

Tang Y J.Patent expiry of indoxacarb pesticides in 2011 - 2015 [J].Pesticides of Today,2012(4): 39-42 (in Chinese)

[3] 水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法标准(GB/T13267-1991)[S].北京：北京市环境保护监测中心,1992： 9-20

[4] 孔志明.环境遗传毒理学[M].南京: 南京大学出版社,2009： 172-174

[5] 俞瑞鲜,赵学平,吴长兴,等.茚虫威对环境生物的安全性评价[J].农药,2009,48(1): 47-49

Yu R X,Zhao X P,Wu C X,et al.Evaluation of indoxacarb to environmental organisms [J].Agrochemicals,2009,48(1): 47-49 (in Chinese)

[6] 吴声敢,吴长兴,陈丽萍,等.两种有机硅表面活性剂和3种农药对斑马鱼的急性毒性与联合毒性研究[J].农药学学报,2009,11(1): 145-148

Wu S G,Wu C X,Chen L P,et al.Acute and joint toxicity of two organosilicon surfactants with three pesticides to Brachydanio rerio [J].Chinese Journal of Pesticide Science,2009,11(1): 145-148 (in Chinese)

[7] FAO.FAO Specifications and Evaluations for Agricultural Pesticides for Indoxacarb [R].Washington DC : Food and Agriculture Organization,2009: 37

[8] National Registration Authority for Agricultural and Veterinary Chemicals.Evaluation of the New Active Indoxacarb [R].Canberra，Australia: National Registration Authority,2000: 13,24-28

[9] European Commission Health & Consumer Protection Directirate-General.Review Report for the Active Substance Indoxacarb [R].Srasbourg，Fance: European Commission,2005: 19

[10] 陈爱梅.吡虫啉和噻虫嗪对对斑马鱼氧化胁迫及DNA损伤[D].泰安：山东农业大学,2013: 29-30

Chen A M.Oxidatice stress and DNA damage induced by imidacloprid and thiamethxam expsoure in zebra-fish (Danio rerio) [D].Taian: Shandong Agricultural University，2013: 29-30 (in Chinese)

[11] 韩颖楠.嘧菌酯对蚯蚓和斑马鱼的氧化损伤及遗传毒性效应[D].泰安：山东农业大学,2013: 45

Han Y N.Effects of oxidative damage and genetic toxicity in earthworms and zebrafish exposed to azoxystrobin [D].Taian: Shandong Agricultural University,2013: 45 (in Chinese)

[12] 曹佳.微核试验在中国的应用、发展与展望[J].遗传,2003,25(1): 73-76

Cao J.The applications,developments and expectations of micronucleus test in China [J].Hereditas (Beijing),2003,25(1): 73-76 (in Chinese)

[13] Marzin D.New approaches to estimating the mutagenic potential of chemicals [J].Cell Biology and Toxicology,1999,15(6): 359-365

[14] Tice R R,Agurelle E,Anderson D,et al.Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo gentic toxicology testing [J].Environmental and Molecular Mutagenesis,2000,35(3): 163-171

[15] 吕莹,张德禄,张宏,等.细胞凋亡检测方法研究进展[J].西北师范大学学报: 自然科学版,2007,43(2): 82-87

Lu Y,Zhang D L,Zhang H,et al.Progress on research method of cell apoptpsis [J].Journal of Northwest Nornal University: Nature Science,2007,43(2): 82-87 (in Chinese)

[16] OECD.Guidelines for the Testing of Chemicals,No.203 Fish Acute Toxicity Test [S].Paris: OECD,1992

[17] 侯欣欣.毒死蜱和TCP对斑马鱼DNA损伤及氧化胁迫[D].泰安： 山东农业大学,2011

Hou X X.DNA damage stress and oxidatice induced by chlorpyrifos and TCP expsoure in zebra-fish (Danio rerio) [D].Taian: Shandong Agricultural University,2011: 33-34 (in Chinese)

[18] 高越,张润祥,王振,等.不同农药单剂及混配微乳剂的环境毒性研究[J].中国农学通报,2011,27(12): 295-300

Gao Y,Zhang R X,Wang Z,et al.Environmental toxicity of several different pesticides single or mixed micro-emulsion [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2011,27(12): 295-300 (in Chinese)

[19] 游泳,林涛,李建宇,等.5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对6种环境生物的急性毒性[J].生物安全学报,2014,23(1),40-45

You Y,Lin T,Li J Y,et al.Acute toxicity of 5% emanectin benzoate on six untargeted species [J].Journal of Biosafety,2014,23(1): 40-45 (in Chinese)

[20] 陈建华,李智,周志华,等.维生素C对草甘膦诱发的斑马鱼外周血红细胞微核及核异常的缓解作用[J].淡水渔业,2013,43(6): 45-50

Chen J H,Li Z,Zhou Z H,et al.The relief of vitamin C on micronuclei and nuclear anomalies of peripheral red blood cells in Danio rerio induced by glyphosate [J].Freshwater Fisheries,2013,43(6): 45-50 (in Chinese)

[21] 陈秀荣,罗宇良,顾泽茂,等.氰戊菊酯对鲤科鱼类致突变效应的研究[J].淡水渔业,2010,40(1): 21-25

Chen X R,Luo Y L,Gu Z M,et al.Study on mutagenesis of fenxvalerat on cyprinidae [J].Freshwater Fisheries,2010,40(1): 21-25 (in Chinese)

[22] 孟顺龙,胡庚东,瞿建宏,等.除草剂阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核和总核异常的影响[J].生态环境,2008,17(1): 178-183

Meng S L,Hu G D,Qu J H,et al.Effects of herbicide atrazine on micronucleus and total nucleus anomaly of erythrocyte in Carassius auratus [J].Ecology and Environment,2008,17(1): 178-183 (in Chinese)

[23] 薛开先,季国芳,孙玉洁,等.微核形成与细胞周期关系的初步研究I.人体全血辐射处理后不同放置和培养时间对微核率的影响[J].遗传学报,1986,13(5): 397-402

Xue K X,Ji G F,Sun Y J,et al.Preliminary studies on the relationship between micronucleus formation and cell cycle I.Effects of various store and cuoture intervals of irradiated human whole blood on micronucleus frequency in lymphocyte [J].Acta Genetica Sinica,1986,13(5): 397-402 (in Chinese)

[24] 薛开先,孙玉洁,周平,等.微核形成与细胞周期关系的初步研究Ⅱ.微核形成的放射性自显影和显微形态学研究[J].遗传学报,1986,13(6): 460-463

Xue K X,Sun Y J,Zhou P,et al.Preliminary studies on the relationship between micronucleus fonmation and cell cycleⅡ.Studies on micronucleus formation by autoradiography and microscopy [J].Acta Genetica Sinica,1986,13(5): 397-402 (in Chinese)

[25] 任培丽,张迎梅,耿广琴,等.污染水域鲫鱼外周血细胞形态和数量的变化[J].动物学杂志,2008,43(2): 37-42

Ren P L,Zhang Y M,Geng G Q,et al.Changes in morphology and quantity of peripheral blood cells in Carassius auratus collected from polluted water area [J].Chinese Journal of Zoology,2008,43(2):37-42 (in Chinese)

[26] 钱晓薇.乙酸铜对黄鳝红细胞微核及核异常的影响[J].江西科学,2004,22(5): 331-333

Qian X W.The effect of Cu(CH3COO)2on the RBC micronucleus and nudclear abnonllity of Monpterus ablus [J].Jiangxi Science,2004,22(5): 331-333 (in Chinese)

[27] 乔琰,鲁志松,姚汉超,等.彗星试验分析指标的进展和应用[J].卫生毒理学杂志,2004,18(3): 190-192

Qiao Y,Lu Z S,Yao H C,et al.Analysis of development and application of the comet assay [J].Health Toxicology,2004,18(3): 190-192 (in Chinese)

[28] 董晓丽.莠去津对斑马鱼解毒酶系的影响及DNA损伤研究[D].泰安： 山东农业大学,2009: 41-43

Dong X L.The toxic effects of atrazine on detoxification enzymes and DNA damage in zebrafish [D].Taian： Shandong Agricultural University，2009: 41-43 (in Chinese)

[29] 高超,华子春.细胞凋亡检测方法新进展[J].中国细胞生物学学报,2011,33(5): 564-569

Gao C,Hua Z C.Progress on detection of apoptosis [J].Chinese Journal of Cell Biololgy,2011,33(5): 564-569 (in Chinese)

[30] Vemes I,Haanen C,Steffens-Nakken H,et al.A novel assay for aopoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptosis [J].Nucleic Acids Research,1997，25(3): 680-681

[31] 武凡,康格非,蒋纪恺,等.膜联蛋白V流式细胞术在肝细胞损害研究中的应用[J].中华肝脏病杂志,2001,9(z1): 24-26

Wu F,Kang G F,Jiang J K,et al.Annexin V technique for the study of liver damage [J].Chinese Journal of Hepatology,2001,9(z1): 24-26 (in Chinese)

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Acute and Genetic Toxicity of Indoxacarb to Zebrafish (Brachydaniorerio)

Feng Qing,Lai Kehua,Huang Weikang,Liu Yushan,Li Jiang,Zhang Chenghui,Fan Yongmei*

College of Environment and Plant Protection,Hainan University,Haikou 570228,China

14 October 2014 accepted 20 April 2015

Indoxacarb is a new and efficient broad-spectrum oxadiazine insecticide,which plays a vital role in agricultural production.With the increase of indoxacarb dosage,more attention is paid to the effects of indoxacarb on aquatic organisms and water quality.Acute toxicity of indoxacarb to Brachydanio rerio was studied,and micro nuclear test,DNA Ladder and Annexin V and propidium iodide double staining were used to detect whether indoxacarb would induce apoptosis,to explore the preliminary toxicity mechanism of indoxacarb.The results showed that indoxacarb was moderately toxic to B.rerio,and 24 h-LC50,48 h-LC50,72 h-LC50and 96 h-LC50of acute toxicity were 2.263 mg·L-1,2.184 mg·L-1,2.184 mg·L-1and 2.133 mg·L-1respectively.B.rerio micronucleus rates in concentration of 1.98 and 2.16 mg·L-1were extremely significant difference (P<0.01),showing that genetic toxicity exists in zebra fish.In the comet assay,the result showed that in the indoxacarb concentration of 1.98 and 2.16 mg·L-1,the significant liver DNA damage were found compared to the control (P<0.01).And the result of Annexin V-FITC /PI revealed that apoptosis happened in the liver cells after B.rerio was treated by indoxcarb for 24 h.The experimental results further proved that the short-term exposure to indoxacarb induce apoptosis in B.rerio,which indicate genetic toxicity of indoxacarb.

indoxacarb; Brachydanio rerio; acute toxity; genotoxicity apoptosis; micronucleus test; comet assay; Annexin V-FITC/PI

国家科技支撑计划项目(2012BAK01B05)；海南省标准化项目(2012-004)；海南省研究生创新科研课题(Hys2014-12)

冯青(1988-),女,硕士研究生,研究方向为农药环境毒理学,E-mail: wodemaitiandi@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: yongmeifan@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141014001

2014-10-14 录用日期：2015-04-20

1673-5897(2015)4-226-09

R994.6

A

范咏梅(1968-)，女，教授，硕导，农药与农产品质量安全系主任，主要研究方向农药环境毒理，园艺作物病虫害防治与农产品质量安全风险评估。

冯青，赖柯华，黄伟康,等.茚虫威对斑马鱼的急性毒性及遗传毒性[J].生态毒理学报，2015,10(4): 226-234

Feng Q,Lai K H,Huang W K,et al.Acute and genetic toxicity of indoxacarb to zebrafish (Brachydanio rerio) [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 226-234 (in Chinese)