分子印迹结合SPR技术检测蔬菜中农药残留

魏传平

(泰山学院化学化工学院，山东泰安271000)

分子印迹结合SPR技术检测蔬菜中农药残留

魏传平

(泰山学院化学化工学院，山东泰安271000)

表面等离子体共振技术(SPR)是利用金属薄膜的光学耦合产生的一种物理“光学现象”.可通过监测SPR的变化，实时监测分子间的相互作用，具有无需荧光标记等特点.分子印迹技术是制备对某一客体分子具有预定选择性材料的过程，利用合成的聚合物内的空穴对模板分子的“记忆效应”来实现对模板分子的选择性识别.本文是以乙酰甲胺膦为模板分子制备的印迹聚合物膜(MIPS)，利用SPR传感器进行检测分析蔬菜中的农药残留，结果表明，此种分子印迹传感器具有较好的印迹效果和选择性能.

表面等离子体共振传感器;分子印迹聚合物;农药检测

农药的种类很多，其中有机氮、有机磷杀虫剂在环境中的半衰期相对较短，对哺乳动物的毒性相对较小，又由于价格便宜等优点，它们占据了绝大多数市场.农药在给农业生产带来好处的同时也造成大气、水体、土壤的污染及在食品中的残留［1－2］.考虑到农药对环境和人类健康的威胁，发展高灵敏度、高选择性的农药残留检测方法显得更加重要.表面等离子体共振技术(SPR)［3］，是一种不需要分离纯化，且不需要标记的实时在线监测技术.通过检测分子间的相互作用，可以确定反应物的种类和浓度.此技术所需试样少且无需标记，检测的速度快、灵敏度高，被广泛应用于食品、环境等监测领域.分子印迹聚合物(MIP)是一种结构预先设计好的大分子人工材料，具有特殊的官能团和分子结构，对待测分子能选择性的识别.MIP不但显示出生物酶和抗体类似的分子选择性，而且具有良好的化学惰性，在水和大多数有机溶剂中不溶.在本文中，我们采用原位引发自由基聚合的方法制备分子印迹聚合物.这一技术和方法对于快速检测农药残留具有一定的实用价值.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FT－SPR 100型表面等离子体共振仪(美国Thermo公司).

甲基丙烯酸(MAA，分析纯)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM，分析纯)、11－巯基十一烷酸(COOH－thiol，95%，分析纯)均购于北京化学试剂公司;乙酰甲胺膦等有机磷农药(百灵威公司).

1.2 实验方法

我们利用原位引发聚合法来制备分子印迹传感器［4］，其原理如下:在传感装置的表面涂上含有单体、模板分子、引发剂的混合溶液，将其放在紫外灯下使混合溶液引发聚合，从而在传感装置表面上形成分子印迹膜.这一方法是较为理想的制备方案.金载玻片，作为传感器芯片浸在10mL的新制备的Piranha溶液中2分钟，取出传感器芯片并用大量的蒸馏水冲洗，用N2吹干待用.然后将其放置在4℃的11－巯基十一酸的乙醇溶液中，反应24小时.依次用乙醇和蒸馏水冲洗传感器芯片，然后将其转入2－乙基－5－苯基异恶唑－3－磺酸的水溶液中30分钟.最后，将该芯片转移到10mL光引发剂ABAH的水溶液中，并保持在20℃的条件下反应3小时.引发剂覆盖的金载玻片在N2气流下进行干燥，并立即用于制备聚合物.将处理过的传感芯片放到溶有模板分子乙酰甲胺膦、单体MAA和交联剂TRIM的乙腈溶液中，通氮气20分钟，密封瓶口.在365nm的紫外灯照射下4°C反应2h.非印迹聚合物膜(NIP)的制备方法不加乙酰甲胺膦，其它步骤同上述.传感芯片安装到SPR仪器时，用洗液进行冲洗，除去未反应的混合物及模板分子.将新鲜黄瓜和油菜洗净切成均匀的小块，这两种样品的处理如下:将10g黄瓜或20g油菜样品冷冻干燥处理24小时，然后加入标准量的乙酰甲胺膦，在研钵中加入聚乙烯聚吡咯烷酮研磨将混合物混合均匀，放置1小时后，将混合物置于离心管中，用丙酮萃取，离心20分钟，重复提取两次，合并提取液，蒸发至接近干燥，将残余物重新溶解在100ml的缓冲液中，将溶液过滤备用.在实验中，FTSPR测定均采用SPR－100共振仪.不同浓度测试化合物溶解于缓冲液中，进入到流动池中，直到波数位移达到稳定值，用FT－SPR实时记录波数的变化.

2 结果与讨论

2.1 印迹聚合物膜厚度的影响

印迹膜的厚度决定了SPR传感器响应的快慢.图1是聚合上非印迹膜及印迹膜后的芯片和裸芯片在缓冲液中的光谱图.由图1可知，裸芯片与印迹聚合物膜结合后，波数红移了929.02cm－1结合上非印迹聚合物膜后，波数红移了228.96cm－1，这表明在SPR传感器表面形成了非印迹和印迹薄膜.据Corn和Weibel的报道［5］，在最优化角度处，膜厚度可通过波数的位移来计算.以此结论为依据估算的SPR芯片上结合的MIP和NIP涂层厚度分别约为22nm和5nm.非印迹膜比印迹膜要薄很多，这可能是因为在实验过程中引发剂不同的反应方式引起的.

图1 室温下，在pH=5.0，0.1 mol/L HAc－NaAc缓冲液中，非分子印迹膜、分子印迹膜修饰的传感器及裸金片的FT－SPR光谱

2.2 pH值对SPR传感器的影响

我们将pH值对分子印迹的SPR传感器亲和性的影响进行了研究，通过改变溶液在3.0－8.0之间的pH值，所得到的结果如图2，从图中可以看出，当溶液的pH从3.0增加到5.0时，分子印迹膜吸附分析物有机膦的量逐渐增加，在pH等于5.0时对有机膦的吸附量达到最大.但是当pH增到8.0时，分子印迹膜对被分析物有机膦的吸附量却减少了.我们推测变化的原因之一是乙酰甲胺膦通过氢键结合到分子印迹膜的印迹位点上.基于功能单体MAA及其聚合物的pKa值我们推断，分子印迹聚合物的等电点可能在pH值为5时.在pH=5时分子印迹膜更靠近于SPR传感器表面，分子印迹位点上功能团的位置与模板分子在形状、大小上更加匹配.所以，在试验中我们将溶液的pH均调在5.0处.

图2pH值对分子印迹的SPR传感器的影响

2.3 印迹聚合物对SPR传感器灵敏度的影响

我们通过实验比较了分子印迹膜与非分子印迹膜作为传感膜的性能.对不同浓度乙酰甲胺膦的印迹效果通过SPR的波数位移得到比较，见图3.与非印迹芯片相比印迹传感器芯片表现出较大的波数位移.对于乙酰甲胺膦分子印迹传感器芯片，当乙酰甲胺膦的浓度为2×10－11mol/L时SPR波数变化达到最大值，尽管非印迹传感器芯片也检测到乙酰甲胺膦的浓度，由于其灵敏度较低，导致SPR波数的变化较小随着乙酰甲胺膦浓度的变化.在图3中，我们仍然发现SPR传感器对乙酰甲胺膦在一定的浓度范围内有很好的线性关系.然而，对于非印迹传感器只有较差的线性度.这是由于印迹传感器芯片对乙酰甲胺膦存在较好的特异性吸附.模板分子乙酰甲胺膦与结合位点的结合常数可以通过Langmuir等温模型［6］求得，结合常数为7.6×1012L/mol，有这一数值更进一步说明分子印迹膜对乙酰甲胺膦具有更高的灵敏性和选择性.

图3 乙酰甲胺膦的浓度引起印迹及非印迹SPR传感器波数的变化

2.4 分子印迹聚合物SPR传感器的应用

利用分子印迹聚合物SPR传感器分析实际样品中乙酰甲胺膦的含量，基于图3，对样品中的乙酰甲胺膦含量进行了测定.表1表明，该方法表明黄瓜中乙酰甲胺膦的回收率为97.1%，而在油菜中的回收率是95.8%.再根据信噪比为3时，黄瓜和油菜的检出限为2.96×10－13mol/L和4.26×10－14mol/L.结果表明，该方法与其他方法相比具有良好的重现性和高灵敏性.

表1 黄瓜和油菜样品的分析结果(n=6)

3 小结

通过在传感芯片表面链接光引发剂制得的分子印迹膜，结合分子印迹与SPR联用技术，对实际果蔬样品黄瓜和油菜中的乙酰甲胺膦进行了检测.结果证明乙酰甲胺膦分子印迹SPR传感器对于乙酰甲胺膦的检测是一种简单高效的方法.

［1］C.M.Torres，Y.Pico，J.Manes.Determination of pesticide residues in fruit and vegetables［J］.J.Chromatogr A，1996(754):301－331.

［2］P.Lea，F.Mladen.Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor［J］.Biosens Bioelectron，2003(18):1－9.

［3］B.Lieberg，C.Nylander，I.Lundstrom.Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing［J］.Sensors and Actuators，1983(4): 299－304.

［4］L.K.Ista，S.Mendez，V.H.Pérez－Luna，G.P.López.Synthesis of poly(N－isopropylacrylamide)on initiator－modified self－assembled monolayers［J］.Lagmuir，2001(17):2552－2555.

［5］R.M.Corn，S.C.Weibel.Fourier transform surface plasmon resonance［M］.New York:Wiley－Interscience，2001.

［6］R.Mazel.Principles of adsorption and reaction on solid surfaces［M］.New York:Wiley－Interscience，1996.

Pesticide Residues Detection in Vegetables Using Molecular Imprinting Technique Combined with SPR

WEI Chuan－ping
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Taishan University，Tai＇an，271000，China)

The technology of surface plasmon resonance(SPR)is a kind of physical optical phenomena generated by the optical coupling of metal thin film.By monitoring the changes of SPR，real－time monitoring the intermolecular interaction，has no need of fluorescent labeled.Molecular imprinting is a method that can prepare polymer material with predetermined selectivity towards a certain guest molecule.The selective recognition of molecularly imprinted polymers to the template molecules is obtained through the"memory effect"of the cavities formed during the polymerization process.This paper is based on the explanation of acephate template molecularly imprinted membrane(MIPS)，and then uses the SPR sensor for residue analysis of pesticides in vegetables detection.The satisfactory results were obtained.

surface plasmon resonance sensor;molecular imprinted polymer;pesticide detection

O631;TS207

A

1672－2590(2015)06－0090－04

2015－10－08

泰山学院青年教师科研基金项目(T12QK07)

魏传平(1977－)，女，山东莱芜人，泰山学院化学与化工学院助教.