hsa-miR-10b在3株宫颈癌细胞系中的表达及靶基因预测

喻妙梅，罗光华，俞天虹，于 洋

（苏州大学附属第三医院综合实验室，江苏常州 213003）

hsa-miR-10b在3株宫颈癌细胞系中的表达及靶基因预测

喻妙梅，罗光华*，俞天虹，于 洋

（苏州大学附属第三医院综合实验室，江苏常州 213003）

目的 分析3株宫颈癌细胞系中hsa-miR-10b表达水平，并预测hsa-miR-10b的靶基因。方法 用PCR技术检测3株宫颈癌细胞系中hsa-miR-10b表达水平;PubMed检索hsa-miR-10b相关文献;miRbase和NCBI分析其序列保守性及所在基因组特征;TargetScan、PicTar及miRanda数据库预测其靶基因，并结合已证实的靶基因对其进行功能和信号通路富集分析。结果 与C-33A相比，HeLa和CaSki中hsa-miR-10b表达水平显著下调（P＜0.01）;hsa-miR-10b与多种肿瘤的发生发展有关;hsa-miR-10b定位于人染色体2q31.1，在各物种之间具有高度保守性;其靶基因主要参与转录、基因表达调控和细胞增殖等生物学过程（P＜0.05），涉及肿瘤、细胞周期和ARF等信号通路（P＜0.05）。结论 hsa-miR-10b功能广泛，与宫颈癌的发生发展密切相关，靶基因的预测为后续研究提供依据。

生物信息学;microRNA;hsa-miR-10b;靶基因预测

*通信作者（corresponding author）:shineroar@163.com

MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码单链小分子RNAs，长度为18～24 nt，广泛存在于真核生物中［1］。目前已证实其参与调控细胞增殖、时序发育和细胞凋亡等生理过程，与肿瘤的发生发展也密切相关［2］。由于miRNAs的调控方式具有“一对多”和“多对一”的复杂网络化特征，使得对miRNAs具体作用机制的认识较为局限。因此，采用生物信息学方法预测并鉴定miRNAs靶基因，对后续机制研究具有重要意义。

目前，人类miR-10的基因序列已经测序成功，研究较多的是miR-10a和miR-10b。hsa-miR-10b在宫颈癌与癌旁组织中差异表达，且人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）阳性与阴性的宫颈癌组织中hsa-miR-10b存在显著差异［3］。本研究通过生物信息学预测hsa-miR-10b的靶基因，对其靶基因进行功能和信号通路富集分析，为研究其在宫颈癌细胞中生物学功能及机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系 C-33A（HPV阴性）、HeLa（HPV-18阳性）及CaSki（HPV-16/18阳性）（中科院上海细胞库）。用含10%胎牛血清（Gibco公司）的MEM培养基（Hyclone公司）于37℃、5%CO2条件下培养C-33A和HeLa细胞，而CaSki用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（Hyclone公司）培养。采用miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒（Tiangen公司）分别进行RNA提取、cDNA反转录及PCR检测。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR检测miR-10b表达:按照试剂盒说明书分别提取细胞总miRNA、反转录cDNA。Real-Time PCR检测的反应条件:94℃2 min，94℃ 20 s及60℃ 34 s，共40个循环。每组设6个复孔，以U6为内参来校正PCR模板的拷贝数，消除组间的加样量误差，重复3次。基因相对表达量采用 2－ΔΔCt方法计算。

1.2.2 文献检索分析:用PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）等工具检索并查阅已发表的hsa-miR-10b相关文献，并进行分析总结。

1.2.3 hsa-miR-10b基因分析:用miRbase（http://www.mirbase.org/index.shtml）、NCBI Map Viewer（http://w ww.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/）等在线工具获取hsa-miR-10b碱基序列、基因定位和物种保守性等基本信息。

1.2.4 靶基因预测:用 TargetScan 6.2（http://www.targetscan.org/）、PicTar（http://pictar.mdc-ber lin.de/）及 miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）靶基因预测网站预测hsa-miR-10b的靶基因，并且取其三者预测结果的交集。

1.2.5 基因本体论分析:综合各预测网站hsa-miR-10b靶基因交集，根据基因本体论（gene ontology，GO）注释中的分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和细胞组分（cellular component，CC）进行GO注释层次分类及富集分析。GO分析采用Cytoscape（http://www.cytoscape.org/）及其插件生物网络基因本体论工具（BiNGO）对靶基因进行功能富集分析（P＜0.05）。

1.2.6 通路富集分析:用DAVID数据库（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）对 hsa-miR-10b 预测的靶基因集合进行基于京都基因与基因组百科全书KEGG（http://www.genome.jp/）和 Biocarta（http://www.biocarta.com/）两个数据库的生物通路富集分析。采用Fisher精确检验计算P值，以P＜0.05为显著性阈值得到基因集合相对于背景具有统计意义的信号传导及疾病通路。

2 结果

2.1 不同宫颈癌细胞系中hsa-miR-10b表达差异

与HPV阴性宫颈癌细胞系C-33A相比，HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa和CaSki中hsa-miR-10b表达水平显著下调（P＜0.01）（图1）。

图1 3株宫颈癌细胞系中hsa-miR-10b表达水平Fig 1 Expression levels of hsa-miR-10b in three cervical cancer cell lines（x ± s，n=6）

2.2 hsa-miR-10b相关文献分析结果

研究表明hsa-miR-10b在多种肿瘤中异常表达，如乳腺癌、胶质瘤、食道癌、膀胱癌、胃癌、鼻咽癌、肝癌、非小细胞性肺癌和胰腺癌等（表1）。

2.3 hsa-miR-10b同源性分析结果

分析结果显示 hsa-miR-10b位于人染色体2q31.1（chr2:176150303－17615041 2），且 miR-10b中“UACCCUGUAGAACCGAAUUUGU”这22个碱基序列在各物种间具有高度保守性（表2）。

2.4 hsa-miR-10b靶基因预测结果

TargetScan 6.2、PicTar及 miRanda数据库检索预测hsa-miR-10b的靶基因分别有271、193、7 048个，其中miRanda预测结果中具有物种保守的靶基因2 761个;取三者预测靶基因交集55个，合并文献已报道但未在预测交集中的靶基因9个:HOXD10、KLF4、TIAM1、TIP30、MMP2、MMP9、CDKN2A、GATA3及MDM2［13］，共 64 个（表 3）。

2.5 hsa-miR-10b靶基因集合的GO功能富集分析结果

hsa-miR-10b靶基因功能主要涉及转录、RNA生物合成和代谢过程、生物大分子代谢过程、基因表达调控、细胞增殖和胚胎发育等生物学过程（P＜0.05）（表4）。

2.6 hsa-miR-10b Pathway富集分析结果

经典通路数据库KEGG中hsa-miR-10b预测靶基因集合显著富集于2个信号传导通路（肿瘤信号通路、细胞周期）和4个疾病通路（膀胱癌、胶质瘤、慢性粒细胞白血病、黑色素瘤）（P＜0.05）;而在Biocarta通路数据库中，基因集合显著富集在ARF、CTCF和VEGF3个信号传导通路中（图2）（P＜0.05）。

表1 已有文献支持的部分hsa-miR-10b功能Table 1 The partial function of hsa-miR-10b surpported by the relative studies

表2 部分物种miR-10b保守序列Table 2 Conserved sequence of miR-10b among partial species

表3 预测的hsa-miR-10b靶标基因集合Table 3 The predicted target genes of hsa-miR-10b

表4 hsa-miR-10b靶基因集合的GO功能富集分析结果Table 4 GO enrichment analysis of the target genes of hsa-miR-10b

续表4

图2 hsa-miR-10b靶基因集合的Pathway通路富集分析Fig 2 Pathway enrichment analysis of the target genes of hsa-miR-10b

3 讨论

近年来，miRNAs与肿瘤的相关性研究已成为热点。本研究PCR结果显示HPV阳性与HPV阴性宫颈癌细胞系相比hsa-miR-10b表达水平显著下调，而HPV是导致宫颈癌发生的必要因素，90%以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染［14］。因此，这一结果提示hsa-miR-10b可能与HPV感染有关，且可能在HPV感染相关宫颈癌发生过程中发挥作用，这对阐明HPV致癌机制和寻找宫颈癌潜在的分子标志物具有重要的意义。

已有研究表明hsa-miR-10b的表达具有组织特异性，既可以通过负性调控靶基因的表达发挥原癌基因的作用，促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，也可以抑制靶基因表达发挥抑癌作用。有文献报道宫颈癌患者癌组织与癌旁组织相比miR-10b的表达显著下调，但机制尚不清楚［3］。这一结果提示hsa-miR-10b在宫颈癌中可能通过负性调控靶基因抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。

本研究分析发现miR-10b序列在多种物种间高度保守，提示其可能具有较大生物学功能。采用TargetScan、PicTar和 miRanda 3种常用的 miRNAs靶基因预测工具进行预测，并取其交集，可提高预测结果的可靠性，有效降低假阳性率。

GO功能和信号通路富集结果显示，hsa-miR-10b靶基因涉及转录、基因表达调控、细胞增殖和胚胎发育等生物学过程，并显著富集于膀胱癌、胶质瘤、慢性粒细胞白血病、黑色素瘤、细胞周期、ARF、CTCF和VEGF信号通路。ARF、CTCF和VEGF信号通路在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。分析结果表明，hsa-miR-10b靶基因显著富集在多个肿瘤通路和与肿瘤发生相关的信号通路中，提示hsamiR-10b可能参与肿瘤发生发展过程的调控，且可能通过调节肿瘤细胞增殖、周期和代谢等影响肿瘤的进程。目前已有的hsa-miR-10b与肿瘤的研究尚未涉及慢性粒细胞白血病和黑色素瘤，提示相关研究值得探讨。

综上所述，通过生物信息学预测hsa-miR-10b的靶基因，并对其靶基因进行功能和信号通路富集分析，对后续研究其在宫颈癌细胞中生物学功能及机制有重要意义。

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Expression of hsa-miR-10b in three cervical cancer cell lines and its target genes

YU Miao-mei，LUO Guang-hua*，YU Tian-hong，YU Yang

（Comprehensive Laboratory，the Third Affiliated Hospital of Soochow University，Changzhou 213003，China）

ObjectiveTo analyze the expression of hsa-miR-10b in three cervical cancer cell lines，and to find the target genes of hsa-miR-10b.MethodsPCR was applied to measure expression levels of hsa-miR-10b in C-33A，HeLa and CaSki.The relative studies on hsa-miR-10b were retrieved from PubMed.The sequence and genome characteristics of hsa-miR-10b were analyzed on line by miRbase and NCBI.The target genes of hsa-miR-10b were searched by TargetScan，PicTar and miRanda，and then demonstrated by Gene Ontology and Pathway Enrichment analysis.ResultsCompared with C-33A，the expression of hsa-miR-10b significantly reduced in HeLa and Caski（P＜0.01）.Current studies showed that hsa-miR-10b was related with multiple tumorigenesis.hsa-miR-10b was located in human chromosome 2q31.1 and highly conserved among different species.The target genes were enriched in the biological processes of transcription，gene expression regulation，cell proliferation and etc.（P＜0.05）.Pathway analysis showed that these target genes were responsible for biochemical erents mediated by to the signaling pathways of cancer，cell cycle，ARF and etc.（P＜ 0.05）.Conclusionshsa-miR-10b may have extensive functions，and closely related with the occurrence and development in cervical cancer.Prediction of target genes provides a theoretical basis for the further study.

bioinformatics;microRNA;hsa-miR-10b;target gene prediction

R73-3

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.018

1001-6325（2015）09-1237-06

2015-04-13

2015-05-25

book=1242,ebook=343