慢病毒介导的Nestin基因沉默抑制人食管癌ECA109细胞增殖

曹燕妮，王华川，王聪懿，朱深银，温剑虎*

（重庆医科大学附属第一医院1.药学部;2.胸心外科，重庆 400016）

慢病毒介导的Nestin基因沉默抑制人食管癌ECA109细胞增殖

曹燕妮1，王华川2，王聪懿2，朱深银1，温剑虎2*

（重庆医科大学附属第一医院1.药学部;2.胸心外科，重庆 400016）

目的 通过体外实验探讨沉默巢蛋白（Nestin）基因对人食管癌ECA109细胞增殖能力的影响及可能机制。方法 合成Lenti-Nestin慢病毒载体，实验设blank组、scrambled组和Lent-Nestin组，转染ECA109细胞，建立稳定沉默Nestin基因的细胞系Lenti-Nestin;用qRT-PCR和Western blot检测Nestin、c-myc和cyclin D1 mRNA和蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖能力;平板集落实验检测细胞的集落形成。结果 稳定沉默Nestin的细胞系构建成功;与blank组和scrambled组相比，Lent-Nestin组中NestinmRNA（P＜0.01）和蛋白（P＜0.05）水平明显降低;细胞增殖能力明显降低（P＜0.01），集落形成能力显著下降（P＜0.05）;沉默Nestin表达后，c-myc、cyclin D1表达明显受到抑制（P＜0.05）。结论 沉默Nestin基因表达可抑制人食管癌ECA109细胞的增殖能力，其可能通过调控c-myc、cyclin D1表达参与其中。

Nestin;食管癌;增殖;基因沉默

*通信作者（corresponding author）:tiger001@163.com

食管癌是严重危害人类健康的消化道恶性肿瘤之一，其发病原因复杂，与患者的年龄、性别、家族史等有关［1］，同时也与多种分子的异常表达密切相关［2］，因此针对肿瘤相关分子的研究已成为当前的研究热点［3］。巢蛋白（nestin）定位于细胞质，主要在未分化及具有分裂能力的细胞中表达，近年来研究发现，其在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用［4］。Nestin在人神经外胚层肿瘤、胶质瘤、黑色素瘤及食管癌等组织中呈高表达趋势［5］，且与食管癌的发生、侵袭与转移能力的获得呈正相关［6］。本研究在此基础上，利用慢病毒介导的Nestin沉默载体（Lenti-Nestin）感染人食管癌 ECA109细胞，构建Nestin沉默的稳转细胞系，并观察沉默Nestin表达对ECA109细胞增殖能力的影响及可能机制，为食管癌早期诊断及综合治疗奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Lenti-Nestin、scrambled序列及转染试剂（上海吉凯基因公司）;胎牛血清、PRMI 1640培养基（Hy-Clone公司）;anti-cyclin D1（Abcam公司）;anti-Nestin（Sigma公司）;anti-c-myc（Bioworld公司）;Total RNA提取试剂盒（Omega公司）;蛋白提取试剂盒和ECL发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 细胞培养与慢病毒感染

人食管癌ECA109细胞（由重庆医科大学附属第一医院肿瘤研究中心储存）培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。感染前24 h，接种细胞2×105个于6孔板中培养24 h，当细胞汇合达到70% ～80%时，根据预实验结果选取含有干扰Nestin效果最佳序列（5'-GGACAAGAGAACCUGGAAATT-3'）及阴性 scrambled序列的病毒液按MOI=10比例感染各分组细胞，24 h后更换培养基，72 h后观察绿色荧光强度，感染效率＞80%时，扩大培养用于后续实验。实验分组为:blank组、scrambled组和Lenti-Nestin组。

1.3 qRT-PCR法

收集对数增殖期的各组细胞，按照Total RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。采用SYBR Green法进行qRT-PCR，用于扩增Nestin目的片段的引物Nestin-F:5'-CTCCAAGAATGGAGGCTGTAGGA A-3'，Nestin-R:5'-CCTATGAGATGGAGCAGGCAAG A-3';β-actin-F:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，β-actin-R:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAAGCA-3'。反应条件:95℃预变性3 min，95℃变性15 s，55℃退火 20 s，72℃延伸20 s，39个循环;采用2-△△Ct法计算并分析。

1.4 Western blot法

收集对数增殖期的各组细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，BSA法测定蛋白浓度，加入适量上样缓冲液于100℃煮沸变性5 min;每孔50 μg，80 V恒压SDS-PAGE电泳，250 mA恒流2 h冰浴电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗（Nestin 1∶500、β-actin 1∶3 000、c-myc 1∶500、cyclin D1 1∶1 000）4℃过夜，次日 TBST漂洗10 min×3次，加入HRP标记的二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，TBST漂洗10 mim×3次，ECL化学发光显影。

1.5 CCK-8法检测沉默Nestin对ECA109细胞增殖能力的影响

收集对数增殖期的各组细胞，计数重悬，按2000个/孔接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后记为0 h，分别在 0、24、48、72 和 96 h 加入 10 μL CCK-8工作液，37℃孵育2 h后，在450 nm处测定吸光度值。

1.6 平板集落实验检测沉默Nestin对ECA109细胞集落形成能力的影响

收集对数增殖期的各组细胞，计数重悬，按2 000个/孔接种于6孔培养板中，37℃、5%CO2培养，2～3 d换液，10 d后取出，甲醇固定30 min，1%结晶紫染色15 min，PBS漂洗后拍照。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件分析，各组实验数据以均数±标准（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。

2 结果

2.1 慢病毒转染ECA109细胞并建立稳定转染细胞系

将Lenti-Nestin及scrambled组慢病毒感染人食管癌ECA109细胞培养72 h后，荧光显微镜观察感染效果，荧光比例达80%以上（图1）时，提示感染成功且稳定表达，可用于后续实验。

图1 荧光观察慢病毒Lenti-Nestin和scrambled感染人食管癌ECA109效率Fig 1 The expression of fluorescence protein in ECA109 cells infected with lentivirus Lenti-Nestin and scrambled（×200）

2.2 ECA109细胞中mRNA及蛋白水平Nestin干扰效率的验证

与blank组和scrambled组相比，Lenti-Nestin组中Nestin基因的表达水平明显下调（P＜0.05，P＜0.01）（图2，3）。

图2 qRT-PCR检测Nestin mRNA表达水平Fig 2 Expression of Nestin mRNA was detected by qRT-PCR（±s，n=3）

2.3 沉默Nestin对ECA109细胞增殖能力的影响

与blank组和scrambled组相比，Lenti-Nestin组中细胞增殖速率明显下降（P＜0.05，P＜0.01）（图4）。

2.4 沉默Nestin对ECA109细胞集落形成能力的影响

与blank组和scrambled组相比，Lenti-Nestin组中细胞克隆团数明显减少（P＜0.05）（图5）。

图3 Western blot检测Nestin蛋白表达水平Fig 3 Expression of Nestin protein was detected by Western blot（±s，n=3）

图4 CCK-8测定沉默Nestin基因表达对ECA109细胞增殖的影响Fig 4 ECA109 cells were infected with Lenti-Nestin or scrambled lentivirus and cell proliferation was evaluated by CCK-8 assay（±s，n=3）

2.5 沉默Nestin对食管癌ECA109细胞cyclin D1、c-myc表达的影响

Lenti-Nestin组中c-myc、cyclin D1蛋白表达水平明显低于 blank组和scrambled组（P＜0.05）（图6）。

3 讨论

图5 平板集落实验检测沉默Nestin对ECA109细胞集落形成能力的影响Fig 5 Colony forming capacity of silencing Nestin expression in ECA109 cells were detected by colony formation assay（±s，n=3）

肿瘤细胞的过度增殖是一个多步骤、多阶段演变的过程，是恶性肿瘤重要的生物学特性之一。近年来研究发现，在肿瘤细胞的增殖过程中众多基因的表达发生了改变或异常，c-myc、cyclin D1在多种肿瘤组织中表达增高［7］，其作为 Wnt、ERK 等信号通路下游重要靶基因，促进肿瘤细胞的增殖［8］。而c-myc、cyclin D1基因表达的下调能明显抑制肿瘤细胞的增殖能力［9-10］。

巢蛋白（nestin）作为中间丝蛋白参与调控细胞周期、细胞分化及细胞的变形、运动等重要的生理过程，同时也在肿瘤的发生与发展过程中起着重要作用。Nestin可通过激活Wnt信号通路，促进乳腺癌细胞的增殖及侵袭的发生［11］，影响FAK和整合素的定位和功能，进而调控前列腺癌细胞侵袭能力［12］。本实验采用RNAi技术将载有Nestin干扰序列的慢病毒 Lenti-Nestin感染 ECA109细胞，构建Nestin沉默的稳转细胞系，并检测NestinmRNA和蛋白在Lenti-Nestin组细胞中的表达。结果显示，Nestin表达水平明显下调，提示Nestin基因被有效沉默。而稳定沉默Nestin细胞系的成功构建为基因的靶向治疗提供稳定、持久的有力工具。Lenti-Nestin组中沉默Nestin基因表达后，ECA109细胞的增殖、集落形成能力明显受到抑制，提示食管癌中高表达的Nestin与肿瘤的恶性增殖密切相关。为了揭示沉默Nestin导致增殖能力下降的原因，进一步检测了c-myc、cyclin D1 蛋白表达，结果显示 c-myc、cyclin D1表达水平明显降低，提示Nestin可能通过调控其表达而影响食管癌的增殖能力。而Nestin如何靶定其相关信号通路分子来介导这一过程目前尚未清楚，有待更进一步的研究。

图6 沉默Nestin基因对cyclin D1、c-myc蛋白表达的影响Fig 6 Expression of cyclin D1 and c-myc protein was detected by Western blot（±s，n=3）

综上所诉，食管癌中高表达的Nestin参与了食管癌细胞的恶性增殖，随着对该基因功能及机制研究的完善，Nestin将成为诊断和预测食管癌的分子标志物和食管癌治疗的新靶点。

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SilencingNestinexpression mediated by lentivirus inhibits human esophageal cancer ECA109 cell proliferation

CAO Yan-ni1，WANG Hua-chuan2，WANG Cong-yi2，ZHU Shen-yin1，WEN Jian-hu2*

（1.Dept.of Pharmacy;2.Dept.of Cardiothoracic Surgery，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo investigate the effect ofNestingene silencing on the proliferation of human esophageal cancer ECA109 cells and possible mechanism.MethodsLenti-Nestinwas constructed and transfected into ECA109 cells to establish a stable Nestin-silencing cell line Lenti-Nestin.Blank group，scrambled group，Lenti-Nestingroup were set up.The expressions of Nestin，c-myc and cyclin D1 mRNA and protein levels were detected by qRT-PCR and Western blot.The cell proliferation was analyzed by CCK8 assay.ResultsThe stable Nestin-silencing cell line was successfully established.The expression ofNestinmRNA（P＜0.01）and protein（P＜0.05）levels were reduced significantly and the downregulation evidently suppressed cell proliferation（P＜0.01）and colony forming capacity（P＜0.05）compare with the scrambled group and blank group.However，The c-myc and cyclin D1 expression levels in ECA109 cells in Lenti-Nestingroup were significantly lower than that of scrambled group and blank group（P＜0.05）.ConclusionsKnockdownNestinexpression significantly inhibits the level of esophageal cancer ECA109 cells proliferation，which may act via influencing the expression of c-myc，cyclin D1.

Nestin;esophageal;proliferation;gene silencing

R735.1;R394.3

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.013

1001-6325（2015）09-1214-05

2015-02-11

2015-04-27

重庆市卫生局重点科研项目（200821H）